2.6. Диагностика бактериозов

Принципы дифференциальной диагностики. Легче всего отличить
по внешним признакам чахлость; значительно труднее это сделать
относительно септицемии и кишечного бациллярного токсикоза,
прежде всего потому, что септицемия может быть первичным явлением
и представлять собой самостоятельное заболевание, но может оказаться
и вторичным явлением — финалом в процессе развития кишечного
бациллярного токсикоза, когда гусеницы в начале инфекции не были
убиты токсином (Рогоф, Юстен, 1969).
Даже при большом опыте и знаниях визуальный диагноз всегда
остается провизорным (предварительным). Окончательный и исчерпывающий
ответ может дать только лабораторное исследование. Ему
предшествует сбор и доставка свежего материала для исследования.
Наиболее достоверный материал для диагноза бактериозов— гусеницы
с четкими признаками болезни, но не агонизирующие. Исследование
же трупов, даже с начальными признаками разложения, может
ввести в заблуждение относительно вида заболевания и состава возбудителей.
Первый вопрос при дифференциальной диагностике бактериозов:
где первоначально сосредоточились и стали размножаться бактерии —
в средней кишке или гемолимфе? Ответ может быть получен микроско-
пированием с помощью иммерсионного объектива окрашенных мазков
из содержимого кишечника и гемолимфы. Мазки целесообразно окрашивать
по Граму, так как, помимо количества бактерий, степени
однородности их состава, морфологической характеристики, станет
известен еще один систематический признак; окраска по Граму основана
на том, что в теле некоторых бактерий — стрептококков, стафилококков,
бацилл — прочно удерживаются красители трифенилмета-
новой группы: генцианвиолет, метилвиолет, криста л лвиолет. Окрашенные
этими красителями микробы, после обработки йодом, не обесцвечиваются
спиртом и при последующей окраске фуксином (красной
краской) сохраняют фиолетовый цвет. Такие бактерии называют
красящимися по Граму или грамположительными, в отличие от не-
красящихся по Граму или грамотрицательных, которые обесцвечиваются
спиртом, после чего окрашиваются фуксинсм в красный цвет
(большинство палочковидных бактерий, не образующих споры).
В начальной стадии заболевания — а ранняя диагностика имеет
ряд преимуществ — бактерий не всегда удается выявить посредством
микроскопического исследования; приходится высевать их на питательные
среды непосредственно на агар в чашки Петри. Этот прием
позволяет быстрее иолучить первичную информацию о численности
и составе бактерий (особенно в гемолимфе, где их в начале заболевания
— считанное количество).
Данные относительно внешней характеристики бактерий, их однородности
и первичной локализации у заболевшей гусеницы могут быть
основанием для предварительного диагноза бактериоза. Однако чтобы
судить об источнике болезни, необходимо установить видовую принадлежность
возбудителя. Для этого выделяют чистую культуру из
изолированной колонии, выросшей на чашке Петри, и высевают на диагностические
питательные среды. Ответ может быть более быстрым
и точным, если идентифицировать (отождествить) выделенных бактерий
с заведомо известными музейными культурами с помощью серологических
реакций.
Изучение состава возбудителей бактериозов в эндемических очагах.
Для чего необходимо определять вид или вариетет (иногда —
штамм) бактерии? В производственной практике, не говоря уже об
исследовательской работе, очень часто возникает необходимость ответить
на такие вопросы: являются ли сопоставляемые заболевания одинаковыми
или разными по составу возбудителей, тождественны ли
по своему происхождению эпизоотии бактериозов в соседствующих
очагах? Можно ли предположить связь между завоеванием выкормок
и эпизоотией, обнаруженной у насекомых в ближайших сельскохозяйственных
угодьях? Сопоставляя видовой состав возбудителем
заболеваний на выкормках прошлого и настоящего сезонов, можно
судить об эффективности мер по ликвидации заразного начала, оставшегося
после предыдущей эпизоотии.
Изучение состава возбудителей бактериозов необходимо для выявления
местных эндемических (в отношении шелкопряда точнее —
энзоотических) очагов в зонах традиционного червокормления.
Заслуживает внимания опыт Среднеазиатского научно-исследовательского
института шелководства (САНИИШ) по изучению локализации
бактериальных эпизоотий в республике, повторяемости их по
годам, с использованием лабораторных методов дифференциальной
диагностики и определения видового состава возбудителей. Работа
проводилась в 30-е годы, в широких масштабах в течение ряда лет»
в наиболее неблагополучных в этом отношении районах. Перед началом
выкормочного сезона сотрудники института направляли в отдаленные
районы специальные посылки для сбора материала. В них
был полный набор предметов и реактивов для приготовления и фиксации
мазков из гемолимфы и содержимого средней кишки больных
гусениц; чашки Петри с мясо-пептинным агаром, иллюстрированные
инструкции о порядке и технике выполнения всех операций. Посылки
предназначались агрономам для разового сбора материала и отправки
его без задержки в институт. В свое время, благодаря этим
посылкам, был собран достоверный и потому особо ценный материал,
выявлены и охарактеризованы очаги поражения выкормок в различных
районах республики, оказана существенная помощь производству
в борьбе с болезнями. В наши дни, при более надежной телефонной
связи и развитой сети авиалиний, такой способ сбора свежего
инфекционного материала в отдаленных районах для лабораторных
исследований стал более доступным.
Определение видового состава бактериальной флоры больных
г\'сениц можно ускорить, сочетая сбор материала с начальной фазой
подготовки его к анализу. Вместо выделения из гусениц чистых культур
бактерий и определения их систематического положения высевом
на диагностические питательные среды рекомендован следующий экс-
ппесс-метод: посев из больных гусениц (гемолимфа, кишечник) производят
на агаризованную питательную среду, непосредственно
в чашки Петри; одновременно исследуют под микроскопом окрашенные
но Граму мазки из того же материала. По виду колоний на чашках
и их микроскопическому исследованию намечают группу бактерий,
представляющих интерес для диагноза заболевания, а видовую и ва-
риететную их принадлежность определяют с помощью серологических
реакций. Для этого запасаются видоспецифическими антисыворотками
к наиболее распространенным возбудителям бактериозов, а для
диагностики вариететов бактерии тюрингиензис — преципитирующи-
мп моносыворотками к ним.
В особых случаях диагностики, когда приходится проверять предполагаемые
возбудители эпизоотии на болезнетворную способность,
ставят биологические пробы: гусениц искусственно заражают через
рот и инъекцией в гемолимфу серией дозировок бактериальной суспензии
и определяют для подопытной партии ЛД50, для каждого
способа заражения в отдельности.
Серологическая диагностика. В перечне средств и методов выявления
возбудителей болезней и определении их систематической
принадлежности исключительное место занимает серодиагностика.
Она позволяет установить присутствие тех или иных видов (вариете-
тов, штаммов) в составе естественной микрофлоры, не выделяя их для
этого в чистые культуры, и следовательно, гораздо быстрее и очень
точно решать главный вопрос диагноза, минуя систему множества
трафаретных операций, из которых состоят традиционные культурально-
биохимические исследования бактерий. Кроме того, серологические
методы исследования способны сообщать существенные дополнительные
характеристики бактерий. В современной серодиагностике
наиболее распространены следующие методы, основанные на реакциях
агглютинации и преципитации.
Реакция агглютинации бактерий на предметном стекле. К капле
суспензии бактерий добавляют каплю антисыворотки к какому-нибудь
определенному виду бактерий; смешивают и устанавливают идентичность
исследуемых бактерий с антисывороткой по наличию хлопьевидного
осадка (рис. 29). Метод этот используют для ориентировочного
исследования, он может быть применен для быстрого установле-
ния вида бактерий в изолированных
колониях, выросших на
чашках Петри или же выделенных
в чистые культуры.
Реакция агглютинации бактерий
в пробирках. В серию
агглютинационных пробирок
наливают антисыворотку (например,
полученную к //-антигену,
т. е. антигену жгутиков
бактерий), разведенную в разной
степени — от 1 : 10 до 1: 10 ООО
(точнее, 1 : 10 240). Затем в эту
сыворотку прибавляют две-три капли бактериальной суспензии.
Степень разведения, при которой еВДе происходит агглютинация, позволяет
судить о степени гомологичности, соответствия друг другу
антигена антителу, т. е. близости гамма-глобулинов бактерий, участвующих
в реакции, и бактерий, использованных для приготовления
сыворотки (рис. 30).
Еще более обильную информацию дают серологические методы,
основанные на реакциях преципитации, в которой участвует масса
антигена разрушенной бактериальной клетки (О— антиген или соматический
антиген). Этот преципитиноген используют для получения
преципитирующей антисыворотки, иммунизируя им животных; он
же участвует в реакциях преципитации (образования осадка) в качестве
антигена, точнее— преципитиногена бактерии, исследуемой на
видовую принадлежность.
Реакция кольцепреципитации— высокочувствительный вариант
использования в серодиагностике преципитиногена; сущность метода
состоит в том, что антисыворотку помещают в узкую пробирку или
капилляр и поверх нее осторожно наносят преципитиноген испытуемой
бактерии; диффундируя навстречу друг другу антисыворотка
и преципитиноген образуют на границе их встречи пристеночное
кольцо преципитата в виде узкой опалесцирующей зоны помутнения.
Определение серотипа бактерии тюрингиензис. Наибольшее применение
в подобном анализе нашли различные модификации реакции
преципитации антигена в геле (Чарный, 1979). Шире других распространен
метод двумерной (двойной) диффузии в геле по Оухтерлони
(1948) и иммуноэлектрофорез. Представление об этих методах можно
получить на примере диагностики вариететов бактерий тюрингиензис
в модификации, разработанной Г. А. Плужниковым (1974).
Приготовление соматического О-антигена из вариететов бактерии
тюрингиензис для получения преципитирующих сывороток. В жидкую
питательную среду Акоевой (Акоева, 1967) засевают четырехсуточную
культуру бактерий и выращивают их на круговой качалке
при 30°С в течение 16 ч. Суспензию бактерий центрифугируют, осадок
суспензируют вновь в физиологическом растворе, бактериальные
клетки разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе (рис. 31) с
частотой 18 кгц в течение 16 ч. Затем для завершения экстрагирования



по ампулам и хранят при температуре— 20°С.
Получение преципитируощей антисыворотки к бактерии тюрингиензис.
Цикл иммунизации кролика состоит из четырех инъекций
по 0,5 мл антигена с интервалом в три дня; первая инъекция — под
кожу, остальные — в ушную вену. После двухмесячного перерыва
кроликов реиммунизируют: антиген вводят в ушную вену в возрастающих
дозах от 0,1 до 0,5 мл, тремя инъекциями с интервалом в три дня.
Через семь днем после последней инъекции у кролика берут кровь
для приготовления антисыворотки, которую сцеживают с поверхности
осевшего сгустка фибриона и форменных элементов крови. Так как для
получения преципитиногена и иммунизации им кролика берут один
из вариететов (чаще— берлинер), антисыворотка содержит, кроме
специфических антител к этому вариетету, весь состав антител к общевидовым
антигенам бактерии тюрингиензис. Реакция групповых
антител в нативной антисыворотке показана на рис. 32. На рисунке
видны линии преципитации, окружающие лунку с нативной аптисы-
вороткой.
Приготовление моносыворотки к отдельным вариететам бактерии
тюрингиензис. Антисыворотку, приготовленную, например, против
вариетета берлинер и содержащую антитела к общевидовым антигенам,
освобождают от последних; для этого ее подвергают истоин-нию,

приливая к ней в эмпирически найденном соотношении преципитино-
гены подобранных для этого вариететов (двух-трех и более). Смесь
оставляют на 1 ч при 37°С, затем выдерживают при 4°С в течение
15—20 ч; образовавшийся преципитат с захваченными им посторонними
антителами удаляют на центрифуге при частоте вращения
3000 об/мин в течение 30 мин. Полученная моносыворотка будет образовывать
преципитат только со специфическим антигеном данного вариетета.
Схема получения моносыворотки методом истощения и реакции
с моносыворотками показаны на рис. 33—34.
Реакция двойной диффузии в геле по Оухтерлони (1962). В чашки
Петри наливают слой агара толщиной в 3—4 мм, в агаре проделывают
пробойником лунки диаметром в 6 мм, одну в центре и восемь лунок
на периферии чашки по окружности с равными друг от друга интервалами
(рис. 35—36).
С помощью этой наглядной реакции можно получить ответы на
ряд вопросов. Чтобы узнать, к какому вариетету относится обнаруженная
у больной гусеницы бактерия тюрингиензис, в центральную
лунку вводят преципитиноген исследуемой бактерии, а в периферические—
моносыворотки к восьми разным вариететам. Втечение полу-
тора-двух дней при температуре 37°С антиген и антитела диффундируют
сквозь толщу агара навстречу друг другу и на линии их
встречи происходит реакция преципитации в теле между гомологичными
компонентами, образуя тонкие беловатые линии осадка в виде
дуг (лиг), лежащих между центральной лункой и той периферийной
лункой, в которой находилась моносыворотка искомого вариетета.
На остальных участках лиги не появляются.
Чтобы уточнить, какие из выделенных во время эпизоотии бактерий
относятся к одному из интересующих вариететов, в центральную
лунку помещают антисыворотку к этому вариетету, а в лунки
по периферии — преципитиногены бактерий, среди которых хотят
обнаружить искомый вариетет.

Можно получить ответ на вопрос, в какой мере идентичны два
антигена по отношению к одной и той же сыворотке. В агаре проделывает
три лунки, размещенные в вершинах равностороннего треугольника:
в две из них вводят сопоставляемые антигены бактерий,
в третью — антисыворотку к ним. Если антигены идентичны, дуги
между каждым антигеном и сывороткой сольются своими сближенными
концами. Если они не имеют общих детерминантов (реагирующих
точек) и антисыворотка содержит к обоим антигенам неидентичные
антитела, то полосы преципитации
пересекут друг друга
(реакция неидеитичностн антигенов).
Если у антисыворотки
есть антитела к общим детерминантам
сравниваемых антигенов
и к детерминантам, которые у
одного антигена есть, а у другого
— нет, то произойдет реакция
частичной идентичности: линия
преципитации между антисывороткой
и гомологичным антигеном
будет полной, а линия
против гетерологичного антигена
— неполной, и в виде упирающегося
в полную линию преципитации
отростка, шпоры (рис. 37).
Метод иммуноэлектрофореза, предложенный Грабаром и Вильямсом
(1953), дает возможность разделить сложные белковые смеси (антигены
и антитела не только по их электрофоретичной подвижности,
но и по их иммунологической специфичности; последнее позволяет
различать одинаковые фракции белка по их физико-химическим свойствам.
Поэтому аналитические возможности этого метода шире обычпи-
го электрофореза или хроматографии. Метод незаменим при распознавании
специфических структурных особенностей антигена (преципитиногена)
у вариететов и штаммов бактерий одного и того же вида или
при выявлении общих антигенных компонентов у белков различного
происхождения. Схема процесса иммунофсреза показана на рис. 38.
Иммуноэлектрофоретический анализ проводят в два этапа. На
первом этапе исследуемый антиген (например, преципитиноген одного
из вариететов бактерии тюрингиензис) помещают в лунку, сделанную
в тонком слое забуферекного агарового геля, нанесенного на стеклянную
пластинку (можно фотографическую 13: 18) и пропускают
через гель постоянный ток. В электрическом поле при слабощелочной
среде молекулы белка с отрицательным зарядом движутся к положительному
полюсу (аноду). Агаровый же гель, при контакте с раствором
электролита тоже приобретает отрицательный заряд. На поверхности
агара располагаются положительные ионы электролита, которые
при пропускании электрического тока движутся к катоду. Наибольшей
электрофоретической подвижностью в толще агара обладают
фракции альбумина, хотя встречный электроэндоосмотический поток

притормаживает их движение. В то время как альбумины продвигаются
все же к аноду, глобулины (вместе с антителами — гамма-глобулинами)
током электролитов, преодолевая электрофоретическое
продвижение белка, увлекаются в противоположную сторону — к катоду
(рис. 39).
На втором этапе иммуноэлектрофоретического анализа после
разделения компонентов белка на электрофоретические фракции
В канавку, проделанную в геле вдоль электрофоретического поля,
вносят антисыворотку к исследуемому белку или моносыворотку для
обнаружения в антигене гомологичных фракций. Антисыворотка
радиально диффундирует в гель, пересекая линию движения фракций
белка, разделенных электрофорезом. На участках эквивалентных
соотношений антигенов и антител каждым гомологичным антигеном
Образуются серповидные опалесцирующие преципитаты, положение которых вдоль длинной оси стекла соответствует электрофоретической подвижности фракций.


По сравнению с другими иммунодиффузионными методами иммуноэлектрофорез
обладает наибольшей разрешающей (разделяюще:1)
способностью при определении числа антигенов. В отдельных электрофоретических
фракциях, осажденных преципитирующими сыворотками,
спектр антигенов в электрофоретической зоне представлен бэлее
или менее обособленными дугами преципитации, выявленными (гсаждсн-
денными) антисыворотками и идущими в одном и том же направлении.
Иммуноэлектрофореграммы (рис. 40) могут быть использованы для
определения также химической природы антигенов путем выявления
в линиях преципитации методами гистохимического анализа белков,
полисахаридов, липидов и отдельных ферментов (Грабар, Буртен,
1963).
Вопросы для самопроверки
1. Какие заболевания обозначают теперь словом фляшерия?
2. Назовите отличительные особенности проявления различных бактериозов
и характера их течения.
3. Какие условия нужны для возникновения септицемии?
4. Каковы отличительные особенности у возбудителя кишечного бациллярного
токсикоза?
5. По каким признакам устанавливают вариететную принадлежность бактерии
тюрингиензис?
6. Каковы характерные особенности факторов патогенеза, участвующих в развитии
кишечного бациллярного токсикоза?
7. Почему и как возникает стрептококковый витерит шелковичных червей?
8. Что представляют собой серологические методы исследования и как с их
помощью устанавливают видовую (вариететную, штаммовую) принадлежность бактерий?
9. С какой практической целью необходимо определение видовой принадлежности
бактерий и какова общая схема выполнения этих исследований?
10. Какова практическая ценность выявления энзоотических очагов бактериозов
и какие методы рекомендованы для их обнаружения?