Глава 3. Вирусные болезни.

3.1. Коротко о вирусах

Открытие вирусов. Благодаря открытиям Л. Пастера, Р. Коха
и их многочисленных последователей во второй половине прошлого
столетия стало общеизвестным, что любая инфекционная болезнь имеет
своего микроба-возбудителя. Причиной заразных заболеваний в то
время чаще всего считали специфические для них виды болезнетворных
бактерий. Однако к концу века накопилось много фактов, когда при
самых тщательных обследованиях больного возбудителя обнаружить
не удалось ни при помощи микроскопа, ни путем выделения и культивирования
микробов на питательных средах.
Эту кризисную ситуацию в учении о природе заразных болезней
удалось преодолеть на пороге XX в. после открытия вирусов русским
ученым Д. И. Ивановским (1892), который исследовал мозаичную
болезнь табака. Сок больного растения, профильтрованный через бактериологические
фильтры Шамберлана, сохранял инфекционность,
хотя самого возбудителя не было видно под микроскопом. Вопреки
утверждению голландца М. В. Бейеринка, повторившего эти опыты
в 1899 г., Ивановский доказал экспериментально, что патоген не может
быть растворимым ферментом или токсином, что он имеет ультра-
микроскопическую корпускулярную природу и не растет на питательных
средах. Так были охарактеризованы основные особенности нового
инфекционного агента и вместе с тем открыт универсальный метод
обнаружения вирусов.
Слово вирус (от лат. вирус — яд) во времена JI. Пастера служило
для обозначения болезнетворных продуктов бактерий или чаще всего
самих возбудителей болезни. По мере того как выяснилось происхождение
многих бактериальных болезней, это слово становилось собирательным
наименованием любого инфекционного начала, природа
которого не была выяснена. Бейеринк впервые применил его по отношению
к возбудителю мозаичной болезни табака. Наука, изучающая
эту группу возбудителей некоторых инфекционных заболеваний, стала
называться вирусологией. Теперь только вирусы бактерий все еще
сохраняют свое первоначальное название бактериофаги («пожиратели
бактерий») или просто — ф аги ; и хотя этот терминологический
сепаратизм (обособленность) бактериологов удерживается в обыден-
ной практике, он в значительной
степени утратил прежнюю целесообразность
после открытия вирусов у
других микроорганизмов—одноклеточных
водорослей, несовершенных
грибов и актиномицетов.
Долгое время фильтруемость вирусов
через мелкопористые фильтры
служила основным признаком, отличавшем
их от других микроорганизмов.
Наряду с отсутствием роста
иа искусственных средах и способностью
размножаться только в жизнедеятельных
тканях, критерий филь-
труемости имел решающее значение
для открытия в последующие годы
многочисленных вирусов в растительном
п животном мире. Много позже
стало очевидным, что вирусы с их
способностью проходить сквозь бактериальные
фильтры, обусловленной
сверхмалыми размерами, не одиноки: д и И в а „ о век и я (lSG4-r.;-,o)
такая же особенность присуща рик-
кетсиям и микоплазме. Помимо размеров,
общим для них является более примитивная организация и
большая или меньшая интеграция их жизнедеятельности с живой
клеткой, в которой они паразитируют.
Недавно фитопатологи обнаружили самых маленьких возбудителей
инфекционных заболеваний растений — вироидов (Динер,
1971). Вироиды представляют собой короткие цепи РНК с низкой
молекулярной массой — 75 000—100 000; ни вирионоподобной организации,
ни капсидного белка у них не обнаружено (рис. 41). После
заражения восприимчивого растения они, подобно вирусам, проявляют
способность к репликации (воспроизведению) РНК, которая
заканчивается разрушением оккупированной ею клетки. Предполагают,
что такие разные болезни, как веретеновидность клубней картофеля
и экзокортис цитрусовых (шелушение нижней части ствола),
вызываются не вирусами, а вироидами. Предпринимаются поиски
вироидных инфекций и у животных; так, выдвинута гипотеза о вироид-
ной природе гепатита (Цукерман, 1973).
Болезни вирусного происхождения у человека, животных, растений
известны по их внешнему проявлению с незапамятных времен;
были найдены даже способы предупреждения (прививки оспы —
Э. Дженнер, 1797), однако причины, их вызывающие, оставались неизвестными.
Через шесть лет после открытия вируса мозаичной болезни
табака была доказана фильтруемость возбудителя распространенной
болезни рогатого скота — ящура (Леффлер, Фрош, 1898),
а в 1901 г. — возбудителя тропической желтой лихорадки (Рид, Кер-
рол и др.); с помощью световой оптики удалось обнаружить возбуди-
теля натуральной оспы
(тельца Пашена, 1906) и
бешенства (тельца Негри,
1903). В 1911 г. установлено
участие вируса в образовании
злокачественных
опухолей (саркомы Роуса).
В 1915 г. открыты вирусы
бактерий — бактериофаги,
в 1933 г.— вирус гриппа,
в 1937 г.— клещевого энцефалита.
В 1948 г. насчитывалось
около 80 видов
вирусов, найденных у чело-
века, а спустя еще 13 лет —
свыше 400. По сравнению
с другими инфекционными
заболеваниями вирусные
болезни оказались наиболее
многочисленными. И
вирусы слабее других патогенов
поддаются воздействию
лекарственных средств.
Вирусами растений, положившими
начало вирусологии,
стали заниматься
— последовательно и повсеместно — только в 30-е годы. Установлено,
что 12 видов растений, которые служат основным источником
питания для большинства населения земного шара, поражаются
96-ю видами вирусных болезней. Тогда же стали поступать
сведения относительно вирусной природы знакомых ранее и новых
болезней насекомых. Вирусология стала подлинным детищем XX в.
после изобретения электронного микроскопа и привлечения серологических
и биохимических методов исследования. Вирусы стали опорным
объектом молекулярной биологии и сыграли исключительную роль
в становлении этого своеобразного комплекса наук, сфокусировавшего
достижения современной физической химии, биохимии и биологии
на решении наиболее глубинных проблем жизнедеятельности
организмов; они были недоступны в прошлом, когда изучение живой
материи ограничивалось клеточным уровнем, а основным инструментом
для проникновения в ее тайны оставался световой микроскоп.
Объект и методы его исследования. При решении вопроса о природе
вирусов приходилось пересматривать представление, предвосхищенное
гениальной догадкой Джироламо Фракасторо (1478—
1553) и окончательно сложившееся в середине прошлого столетия,
что непосредственной причиной инфекционных заболеваний является
микроскопическое живое варазное начало— contagium vivum. Так
как единицей живого, по понятиям того времени, могла быть только
yS чд-V-’ :•* :• :Л — Т у \DNA
ЧлГ- ;lWZX-l-'A-L-,--'
p s t v :-'-

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

клетка, а размер большинства вирусов был слишком мал для клет*
ки — от 20 нм1 (вирус ящура) и до 455 нм (вирус пситтакоза — болезни
попугаев) — было непонятно, как может осуществляться многообразие
жизненных процессов в частице, вмещающей в себе считанное
количество молекул белка. Вторая особенность вирусов, вызывавшая
сомнение в принадлежности их к миру живых существ,— неспособность
к жизнедеятельности и размножению на мертвой питательной среде.
Деятельность вируса всецело зависит от обмена веществ у его носителя.
Размножение фага в культуре бактерий тесно связано с состоянием
обмена веществ у самих бактерий. У высших растений размножение
вируса обычно связано с фотосинтезом. Репродукция вирусов
может идти лишь в пораженной ими клетке и на основании обмена веществ
в этих клетках, той энергии, которая в них возникает, и тех
ферментов, которые в этих процессах участвуют. Во всяком случае,
вир усы-са профиты пока неизвестны.
Необходимо отметить, что взаимоотношения вирусов с живыми
организмами не ограничиваются только явным паразитизмом. Существуют
и другие формы использования ими своего носителя. Патогенные
для растений и животных вирусы могут находиться в организме
насекомого-переносчика и даже размножаться в нем, не причиняя
своему хозяину видимого вреда. Известно также, что вирусы
могут присутствовать в растениях и вызывать в них морфологические
изменения, которые прежде принимались за мутации (вирус пестро-
лепестности тюльпана).
Вследствие гедсступных для светсвой оптики размеров и строго
облигатного типа паразитизма для диагностики болезней и изучения
самих вирусов (с самого начала рождения вирусологии) применялись
и применяются методы их обнаружения, сочетающие фильтрацию исследуемого
материала через мелкопористые фильтры с биологической
пробой, т.е. с заражением восприимчивого организма этим фильтратом.
Познавательная возможность этого метода ограничена и сводится
к констатации присутствия вируса в исследуемом объекте. Между
тем в свете достижений молекулярной биологии, благодаря электронной
микроскопии, привлечения методов и технических средств физической
химии и биохимии, стало очевидно, что вирусы, как все
живое, располагают закодированной программой жизнедеятельности,
что сверхмалые размеры этих существ стали возможными в результате
использования вирусом цитоплазмы оккупированной ими живой
клетки и прежде всего ее ферментов. Вместе с тем такая миниатюризация
живого организма стоила ему утраты собственной независимости
при осуществлении своего воспроизводства.
В отличие от других микроорганизмов вирусы не могут быть обнаружены
с помощью светового микроскопа и тем более изучены
при его участии. Исключение составляют только некоторые вирусы,
способные образовывать в тканях зараженного организма особые,
относительно крупные включения, содержащие в себе вирус: к ним
1 Наном&тр (нм) — миллионная доля миллиметра, одна тысячная доля микро-
мётра (мкм)-

относятся тельца Пашена при оспе и тельца
Негри при бешенстве, полиэдры и гранулы
при вирусных заболеваниях насекомых
или овоиды при поражении их энтомопокс-
вирусом, а также некоторые кристаллические
включения и икс-тела при вирусных
заболеваниях растений. Самих же вирусов
никто не видел, и этот решающий
для их познания акт длительное время не
мог состояться. Морфология вирусов —
внешний вид их инфекционной единицы—
продолжала оставаться уделом изобразительной
фантазии ученых.
Переломными в этом отношении стали
30-е годы, когда началось конструирование
электронного микроскопа. Впервые
фотографический портрет вируса, увеличенного
в 45 тыс. раз, с помощью этого прибора
в 1939 г. получили немецкие ученые
Кауше, Пфанкух и Руска. Это было несовершенное
изображение двух палочковидных
телец вируса табачной мозаики (300x15 нм). Поток электронов
в микроскопе, столкнувшись с ними как с препятствием, образовал
на фотопластинке их теневое изображение. В последние годы разрешающая
способность электронного микроскопа доведена 'до 0,8 нм,
что позволило получать полезное увеличение в 250 тыс. и более раз
и фотографировать не только вирусы, но и отдельные крупные
молекулы вещества. Сейчас разрешающая способность микроскопов
экстракласса достигла 0,2 нм (рис. 42).
Благодаря специальным методам приготовления препаратов, усиливающих
рельефность изображения, удалось выявить тонкую структуру
отдельных компонентов вирусов. На полученных с помощью
ультрамикротома ультратомированных, сверхтонких срезах (15—
20 нм) тканей насекомого, содержащих вирус, или на срезах через
вирусные включения (полиэдры, овоиды) можно было проследить за
отдельными этапами формирования вирусов. Стало возможным использовать
морфологические особенности вируса в качестве систематического
признака. Электронная микроскопия помогла получить сведения
о размерах вирусов более точные, чем ультрафильтрацией через мембранные
фильтры или на основании скорости седиментации при центрифугировании.
Микроскопирование при больших увеличениях позволяет
судить о степени однородности корпускулярных элементов в поле
зрения и о степени очистки вирусного препарата от сопутствующих
компонентов клетки. Дальнейшее совершенствование электронного
микроскопа на основе сочетания его со сканирующим (обегающим,
развертывающим) устройством, обеспечивающим стереоскопичность
изображения, еще более повысила возможности визуального анализа
микроскопических объектов.
В отличие от бактерий и микроскопических грибов вирусы не
могут быть выделены из зараженного субстрата в чистые культуры
и размножены на искусственных средах. Однако многих из них оказалось
возможным сохранить или размножить вне организма на
культуре тканей или клеток. Для этого подбирают ткани, особенно
чувствительные к вирусу, обычно — эмбриональные. Последние,
как менее дифференцированные, с менее выраженными видовыми
свойствами, могут быть использованы для культивирования вирусов
более широкого систематического состава. Так, для культивирования
вируса ядерного полиэдроза используют личиночные ткани тутового
шелкопряда — гемоциты, клетки жирового тела и ткани оболочек
гонад. В отличие от культурального метода изучения бактерий с целью
их видовой идентификации, назначение культивирования вирусов,
помимо возможности их накопления этим методом, состоит в том,
чтобы поэтапно проследить за процессом их развития в живом организме.
Хотя открытия вирусологов шли в ногу со стремительным развитием
науки XX в., ученые получили возможность вплотную приблизиться
к более полному знанию физико-химической природы вирусов
только в последние десятилетия, когда были разработаны спссобы
очистки вирусов от чужеродных белков. Для этого используют богатейшим
современный арсенал лабораторно-технических средств и методов
физической и биологической химии, разработанных для получения
чистых препаратов биогенных молекулярных соединений,
в частности ферментов. Они подбираются в зависимости от строения
вирусов, степени их инфекционной стабильности, других особенностей,
конкретной задачи, преследуемой очисткой, а также сообразно объекту,
из которого предстоит выделить вирус.
Наиболее универсальный способ очистки вирусов — дифференциальное
центрифугирование. Для этого используют препаративные
ультрацентрифуги с частотой вращения
ротора до 60 тыс. об/мин, с
устройством для контроля за температурой
в камере с исследуемым
материалом. Источником вируса служат
ткани или гемолимфа больного
насекомого. Ткани тщательно растирают,
фильтруют через многослойный
бумажный фильтр или центрифугируют
при малой частоте вращения
(3—5 тыс. об/мин). Чтобы освободить
фильтрат (или центрифугат) от микроорганизмов,
сопутствующих вирусной
инфекции, его снова фильтруют
через бактериальные фильтры, например,
через фильтр Зейца (рис. 43).
Полученный фильтрат используют
далее для детальной очистки путем
дифференциального центрифуги-


рования. Сначала его освобождают от наиболее значительных по размерам
ингредиентов (составных частей) центрифугированием па препаративной
ультрацентрифуге при частоте вращения 20—30 тыс. об/мин
(рис. 44). Мелкие частицы тканей оседают скорее, чем вирусы, но
последние переводятся из осадка во взвешенное состояние (ресуспен-
зируются) легче, чем тканевые частицы. При повторных операциях
центрифугирования и ресуспензирования чередуют интенсивность
осаждения в центробежном поле при больших и малых скоростях.
Весь режим дифференциального центрифугирования подбирают таким
образом, чтобы длительность зтого процесса обеспечила наименьшие
потери не ссевших частиц вируса при удалении их с надосадочной
жидкостью перед ресуспензированием. В итоге может быть получен
препарат вируса, очищенный в значительной степени и содержащий
не более 10% примесей. Дифференциальное центрифугирование часто
сочетают с другими способами очистки вирусов: с ссаждением сульфатом
аммония или с осаждением в изоэлектрпческой точке, а также
с адсорбцией в ионнообменной хроматографии, которая более пригодна
для вирусов насекомых.
Очистка с помощью хроматографической адсорбции выполняется
на иопнообменных колонках, которые наполняют ионнообмениыми
смолами, производными целлюлозы и другими адсорбентами, способными
избирательно сорбировать (поглощать) вирусы, а затем достаточно
полно элюировать (вымывать) их. В этих колонках вирусы и сопровождающие
их чужеродные компоненты адсорбируются на разных
уровнях колонки и могут быть извлечены отдельно друг от друга.
Широкое распространение получило равновесное центрифугирование.
Центрифужную пробирку заполняют химически инертным веществом
с достаточной степенью вязкости так, чтобы плотность его
уменьшалась в направлении от дна к мениску. Чаще всего для этого
используют растворы гахарозы или цитрат и тартрат калия, реже —
глицерин и др. Роль градиента плотности1, образованного этими веществами,
заключается в том, чтобы при скоростном центрифугировании
препятствовать конвекции и фиксировать разные по своим физическим
свойствам молекулы в определенных зонах. Материал, который
подвергают осаждению, наслаивают перед центрифугированием на
мениск сахарозы, на вершине ее градиента. При кратковременном
центрифугировании (0,5—3 ч) компоненты смеси оседают со скоростями,
определяемыми их относительными коэффициентами седиментации;
во время центрифугирования они распределяются по фракциям в виде
характерных опалесцирующих поясов — зон, отличающихся по скорости
осаждения: это так называемое зональное разделение в перфор-
мированном, заранее образованном зональном градиенте. При длительном
центрифугировании (6— 12 ч), если плотность зон достаточно
велика, процесс осаждения продолжается до тех пор, пока все частицы
не достигнут уровня в градиенте, где плотность среды равна их
собственной плотности. Фракционирование в этом случае происходит
в соответствии с разницей их плотности: это равновесное, или изопик-
ническое, зональное разделение.
После того, как фракции градиента собраны, для идентификации
(распознавания) вируса можно использовать различные методы:
испытание инфекционности, исследование спектров поглощения в
спектрофотометре, анализ с помощью электронного микроскопа или
серологических методов. Обычно идентифицируют не одним, а несколькими
методами.
Из других методов очистки вирусов применяют электрофорез
в агаровых, агарозных и полиакриламидных гелях, а также гель-
фильтрацию. Распространена гель-фильтрация с использованием се-
фадекса — производного полисахарида декстрана. Гранулы его, набухая
в воде, образуют гель, поры которого представляют собой сито,
способное пропускать глобулярные частицы с молекулярной массой
от 50 тыс. до 200 тыс., что показано маркировкой сефадекса (тонкий
G — 50, сверхтонкий G — 200). После введения в сефадекс ионнообменных
функциональных групп он приобретает способность, помимо
гелевой фильтрации, участвовать в очистке материала с помощью
ионного обмена, значительно облегчая этим разделение фильтруемых
веществ.
Эффективность очистки вирусов можно оценить несколькими методами,
в чагтности, с помощью спектрофотометра или аналитической
центрифуги со шлирен-оптикой, позволяющей получать седимен-
тограммы (запись осаждаемости), на которых видна степень чистоты
1 Градиент плотности — постепенное увеличение плотности раствора в центрифужной
пробирке от верхних слоев к нижним,

и однородности по этому признаку анализируемого материала
(рис. 45—46). С помощью этих методов получают информацию о составе
вещества без предварительного разделения средствами аналитической
химии на его компоненты.
Для идентификации вирусов, обнаружения их различий в пределах
узких в таксономическом отношении групп (разновидностей и штаммов),
установления их индивидуальных особенносте! широко применяются
серологические методы анализа. В серологическом отношении
вирусы автономны и совершенно отличны от белков того организма,
в котором они размножаются. Вирусы могут быть обнаружены, а их
систематическсе положение может быть определено с помощью различных
модификаций реакции преципитации, в том числе в геле, а также
с помощью иммуноэлектрофореза.
Для решения топографических вопросов накопления вирусов
в клетках и тканях, динамики и путей распространения в организме,
для определения количества пораженных клеток и других аналогичных
исследований применяют маркировку антител (сывсроток): это
могут быть антитела, несущие радиоактивную метку, ферритин —
конъюгированные антитела (антитела, комплексированные феррн-
тином — железосодержащим белком с небольшими молекулами, которые
легко выявляются при электронном микроскопировании) и, наконец,
антитела, меченые флюоресцирующими красителями. Меченые
антитела в сыворотках иммунизированного вирусом животного реагируют
в исследуемой ткани прижизненно с этим же вирусом и безошибочно
указывают на его присутствие по метке у антител.
Для наблюдения за синтезом вирусных белков и нуклеиновых кислот
используют цитохимические методы исследования, а вт о р а д и о г
р а ф и ю с применением в качестве метки радиоактивных изотопов;
используют также блокировку отдельных этапов обмена веществ и биосинтеза
с помощью антиметаболитов.
Вирионы и их строение. Единичная зрелая особь вируса («вирусная
частица», «инфекционная единица вируса») — вирион приспособлен
к жизни вне клетки в покоящемся состоянии и располагает морфо-
лого-биохимическими средствами для последующего проникновения
в зараженную клетку. Вирион состоит из одиночной или двойной
нити ДНК или РНК, окруженной белковой оболочкой, строение которой
обусловливает его форму. Морфологические субъединицы, из
которых сложена белковая оболочка, под электронным микроскопом
имеют форму шаровидных или яйцевидных тел и называются капсо-
мерами. Они образованы одной или несколькими белковыми молекулами,
состоящими из большого количества аминокислотных остатков.
Уложенные определенным образом капсомеры образуют белковый
футляр — капсид, форма которого образована укладкой капсомер
и соответствует одному из двух типов симметрии: спиральной (геликоидной)
или кубической. Первый тип — у палочковидных вирусов;
их капсид представляет собой цилиндр со стенкой, состоящей из спирально
расположенных капсомер и своим видом несколько напоминающей
кукурузный початок. Второй тип свойствен шаровидным, сферическим
вирусам и относится к одному из трех форм кубической симметрии,
встречающейся в природе — к икосаэдру (двадцатиграннику).
Капсид представляет собой однослойное белковое образование, уложенное
из радиально ориентированных капсомер; поверхность такого
многогранного сферического тела похожа на фасетчатую структуру
сложных глаз насекомого.
Систематика вирусов. В 40-х годах нашего столетия появились
попытки классифицировать вирусы растений и животных. В итоге
электронномикроскопического и биохимического изучения вирусов
были установлены основные особенности, отличающие их от остальных
организмов: наличие только одной из двух нуклеиновых кислот в составе
вириона, отсутствие клеточной структуры и независимого (автономного)
обмена веществ.
Все вирусы разделили на два подтипа по наличию одной из двух
нуклеиновых кислот (ДНК или РНК); на сснове симметрии иуклео-
капсида: спиральной — у палочковидных вирусов или кубической —
у сферических — вирусы разделены на классы. Затем классификацию
вирусов дополнили еще одним показателем — числом нитей нуклеиновой
кислоты (одно- или двуннтчатая) и некоторыми другими характеристиками:
молекулярная масса, процентное содержание нуклеиновой
кислоты в вирионе, заражаемые вирусом организмы (позвоночные,
беспозвоночные, бактерии). Было предложено, для краткости и большей
наглядности, зашифровать основные показатели, характеризующие
каждую систематическую группу вирусов, в форме криптограммы
(Гиббс, Харисон, 1968). Например, для ядерного полиэдроза она
имеет следующий вид(Тарасевич, 1975): [Л/2; 80—100/8—15; U/E; I/O] ,
где первая пара — тип нуклеиновой кислоты (D — ДНҚ, R — РНК)
и число нитей в молекуле (2 — двунитчатая, 1 — однонитчатая);
вторая пара — молекулярная масса нуклеиновой кислоты в миллионах
дальтон1 и содержание нуклеиновой кислоты в вирионе в процентах;
третья пара — форма вириона и форма нуклеокапсида; в данном случае
U — обозначает удлиненную, с параллельными сторонами и округленными
концами, а Е — удлиненную, с параллельными сторонами,
с незакругленными концами; четвертая пара — тип инфицируемого
организма (/ — Invertebrate, беспозвоночные) и тип переносчиков;
в нашем случае —О, т. е. вирус распространяется без помощи переносчика.
Несмотря на некоторые удобства, трудно ожидать широкого распространения
криптограммирования признаков, характеризующих
вирусы, так как подавляющее количество их, в том числе вирусов
насекомых, далеко не сразу после их обнаружения и предварительного
описания получают всю необходимую для этого характеристику.
Так, криптограмма рабдовирусов, у которых известен только внешний
вид вирионов и то, что он обнаружен у насекомых (дрозофилы), будет
выглядеть так: ?/?; ?/?; U/?; I/O.
Избирательный характер вирусного поражения. Придя в соприкосновение
с клеткой восприимчивого организма, вирус выходит из
покоящегося состояния; его морфолого-биохимический аппарат для
проникновения в инфицируемую клетку начинает функционировать,
обеспечивая осуществление двух последовательных операций — контакт
и проникновение.
Гистотропизм, предполагающий способность инфекционного агента
к активному перемещению в направлении к восприимчивой ткани,
относительно вирусов экспериментально не подтвержден. Контакт
вириона с клеткой оказывается возможным в результате случайного
сближения его с клеточной поверхностью. Создается впечатление^ что
на очередность поражения тканей в организме насекомого решающее
влияние оказывает степень накопления вируса в гемолимфе и интенсивность
доставки инфекционного начала циркулирующей полостной
жидкостью к отдельным органам. Если роль гистотропической ориентации
в пространственном распределении вирусной инфекции неясна,
то избирательный характер внедрения вируса в клетку не вызывает
сомнений. Специфичность вируса проявляется в способности внедрения
в клетку на определенном ее участке. Она объясняется сродством
(аффинитетом) белковой оболочки вириона и инфицируемой клетки,
наличием у вируса и заражаемой клетки структурных особенностей,
которые, выражаясь обобщенно, носят комплементарный (взаимодополняющий)
характер. Участки с такими структурными особенностями
на поверхности клетки называются рецепторами и представляют
1 Дальтбн — единица массы, равная Vu массы изотопа углерода С1*.
собой определенную группировку белковых, липидных и углеводных
компонентов, с которыми реагируют соответствующие участки капсида
вириона.
У вируса инфекционная специфичность определяется белком капсида.
Насекомое, невосприимчивое к данному вирусу вследствие
того, что клетки его тканей не имеют комплементарных с вирусом рецепторов,
могут быть заражены искусственным путем нуклеиновой
кислотой вируса, предварительно освобожденной от капсида. Вирио-
ны, образовавшиеся в клетках после заражения их «раздетой» нуклеиновой
кислотой, будут иметь нормальное строение капсида, свойственного
этому вирусу, что обусловлено генетическим кодом нуклеиновой
кислоты, использованной для заражения. Поэтому капспдный белок
вирионов нового поколения не будет иметь с клеткой, в которой сн был
сформирован, комплементарных рецепторов, и не сможет участвовать
в процессе дальнейшего перезаражения подобных клеток.
Рецепторы вирионов могут утратить способность взаимодействовать
с рецепторами клетки после изменения структуры белка капсида
под влиянием мутации вируса или химического воздействия.
Мутационная изменчивость рецепторов способна, вероятно, вызвать
среди вирусов насекомых появление новых инфекционных агентов,
опасных для тутового шелкопряда. Какова доля вероятности появления
такой мутации, способной пополнить ряды патогенов шелковичных
червей, предвидеть трудно.
Вначале контакты вируса и клетки носят обратимый характер.
Между их рецепторами устанавливаются, по-видимому, электростатические
взаимодействия разноименно заряженных группировок ионов.
Очевидно, связь такого типа можно нарушить различными средствами,
способными вызвать потерю электрического заряда ионными
группами, например, в присутствии сильных кислот и оснований.
Затем вследствие глубоких структурных преобразований, происходящих
с вирионом и клеткой, возникают между ними необратимые
связи.
П р о ц е с с п р о н и к н о в е н и я в и р у с а в к л е т к у . Эти необратимые изменения
во взаимодействии вируса и клетки намечаются при проникновении
е г о в клетку и сопровождаются перестройкой конфигурации
протеинов капсомер, изменяющей третичную структуру их белка;
вирус становится податливым к воздействию на него протеолнтнче-
ских ферментов клетки, к которым он в своем интактном (не нарушенном)
состоянии полностью устойчив.
Вирус проникает в клетку посредством акта, представляющего
собой частный случай пиноцитоза: на участке соприкосновения его
с клеткой образуется впячивание клеточной мембраны, которая превращается
в вакуоль, так называемую пиносому или пиноцитозный
пузырек. При своем образовании она захватывает вирион и погружаетс
я вместе с ним в цитоплазму клетки, становясь ее вакуолью. По отношению
к вирусам этот механизм инфицирования клетки назван виро-
пексисом (Фазекас де Ст. Грот, 1948). Пссле прикрепления вириона
к поверхности клетки и одновременно с ходом виропексиса вирион
расчленяется на отдельные структурные компоненты. Еще до погружения
вириона в клетку контуры его утрачивают первоначальную четкость,
расплываются, исчезают характерные черты его архитектоники,
растворяются липидные компоненты оболочки, капсид разрушается и
элюируется во внешнюю среду. Эта дезинтеграция (распад на составные
части) осуществляется при участии протеолитических ферментов
клеточной оболочки и цитоплазмы клетки. Заключительная стадия
взаимодействия рецепторов клетки и вириона — протеолиз белка
капсида завершается внутри клетки, в периферической зоне ее протопласта,
где вирусная ДНК окончательно освобождается от оболочки
вириона.
Оккупационная и репродукционная деятельность вируса. Появлению
нового поколения вирионов в оккупированной вирусом клетке
предшествует подавление деятельности клеточного генома, вплоть до
его разрушения; генетическим аппаратом клетки становится вирусная
нуклеиновая кислота, а соматическим — вся клетка. Нуклеиновая
кислота вируса взаимодействует с клеткой, синтезирующий ферментативный
аппарат которой воспроизводит основные структурные
системы вируса — нуклеиновую кислоту и белки, но уже по программе,
заложенной в генетическом коде вируса (Бергольд, 1956; Товарниц-
кий, 1966).
Непосредственно после проникновения вируса в клетку и до возникновения
в ней нового поколения вирионов вирус в клетке не обнаруживается
ни визуально, с помощью электронного микроскопа, ни
серологически, вследствие дезинтеграции (распада) его антигенной
структуры, ни биологической пробой (путем заражения восприимчивого
насекомого или культуры его клеток) из-за утраты вирусом
инфекционной способности. Индивидуальность вируса как бы растворяется
в оккупированной им клетке. Эта начальная фаза преобразования
вируса в клетке называется эклипс-фазой. Основное в ней — подавление
информационной деятельности генома клетки и переключение
ее на новый источник информации, закодированной в геноме вируса.
Поэтому получившее распространение английское название этой фазы
(англ. eclipse — затемнение) уместно было бы заменить наименованием
фаза смены информации или сокращенно — СИ-фаза (Соловьев, Баландин,
1969). За СИ-фазой идут интенсивные процессы синтеза и воспроизведения
нового поколения инфекционных единиц вируса — вирионов.
Механизм возникновения нового поколения вируса совершенно
отличен от размножения клеток путем их деления на дочерние особи,
поэтому вирусологи вместо слова размножение предпочитают понятие
репродукции вирусов, т. е. воспроизведение копии по ее оригиналу.
Макромолекула ДНК вируса воспроизводится посредством репликации,
копирования. Родительская двойная спираль полинуклео-
тидной цепи ДНК расходится и каждая из цепей служит матрицей
(шаблоном) для сборки дочерней цепи путем достройки этих продольных
половинок ДНК за счет присоединения к ним недостающих комплементарных
свободных нуклеотидов. Старая материнская половинка
вместе с новой образует двухцепочечную ДНК; синтезом этих половинок
молекулы нуклеиновой кислоты воспроизводится геном для новой
генерации вируса.
Как показали опыты, при наличии в бесклетсчных, искусственно
подобранных системах ДНК-матрицы, фермента ДНК-полимеразы
и четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов можно получить ДНК,
тождественную или весьма близкую к матричной по составу и нуклео-
зидной компоновке нуклеотидов. Синтез ^вирусной двухцепочечной
РНК имеет общие черты с репликацией ДНК, но у одноцепочечных
геномных вирусных РНК она протекает иначе: одноцепсчечный полинуклеотид
может в начале заражения им клетки служить информационной
РНК, непосредственно выполняющей роль матрицы при синтезе
белков, часть которых используется для репликации вирусной РНК.
У вирусов синтезы нуклеиновых кислот и структурных белков
капсида разобщены территориально и во времени. Они начинаются
после перестройки метаболизма клетки, протекают на разных ее структурах
и накапливаются в определенном месте. Этот так называемый
дизъюнктивный, или разобщенный, способ производства потомства
совершенно отличен от механизма размножения клеточных организмов.
Затем обе составные части — макромолекула нуклеиновой кислоты
и белок капсида — осуществляют самосборку вириона. В подтверждение
сказанному удалось продемонстрировать получение восстановленной
структуры вириона простым смешением вирусного белка
и ДНК у разных вирусов, в том числе у вируса ядерного полиэдроза
дубового шелкопряда (Гершензон, 1956).
Развитие вируса в клетке сопровождается заметными морфологически
выраженными повреждениями клетки, биохимическими и функциональными
нарушениями. Заключительная стадия репродукции вируса
— формирование зрелых вирионов. Клетка заполняется ими,
разрушается, содержимое ее, вместе с вирионами или1 вирусными включениями,
оказывается во внутренних полостях насекомого.