2.4. Кишечный бациллярный токсикоз

История открытия патогена. В 1902 г. С. Ишивата сделал сообщение
«относительно тяжелой формы фляшерии — обморочной болезни
». Он наблюдал ее на выкормках шелкопряда, пораженных
жестокой эпизоотией, выделил и описал возбудителя (1905— 1906).
Выросшие на агаризованной среде старые культуры этой бактерии
в возрасте от одной недели и до девяти месяцев при скармливании
гусеницам оказались смертельными. Ишивата назвал возбудителя
сотто-бациллой (япон. сотто — обморок). Через несколько лет к находке
Ишиваты обратились микробиологи медицинского факультета
Токийского университета Аоки и Чигасаки (1915). Они подтвердили,
что токсины так называемой сотто-бациллы Ишиваты содержатся только
в старых культурах, а токсическое вещество ассоциируется со спо-
рулирующими культурами в качестве бациллярного эндотоксина.
При скармливании старых культур гибель гусениц наступает в течение
трех часов, а при инъекции в гемолимфу — не только старых, но и молодых
культур — неизбежно возникает острая септицемия. Патогенное
действие не всегда связано с предварительным размножением
бактерий в кишечнике. Однако, если доза токсина в результате скармливания
бактерий оказалась не летальной, бактерии успевают размножиться
в средней кишке; под влиянием их токсического воздействия
станка кишечника утрачивает барьерные свойства, бактерии начинают
проникать в общую полость, возникает септицемия.
Эпизоотия, которую описал Ишивата, по мнению шелководов Японии
не была исключительным явлением. В годы обильного размножения
вредителей из отряда чешуекрылых среди них наблюдались эпизоотии,
вызванные, как потом установили, сотто-бациллой. Гусеницы-
вредители тутовых плантаций становились средством для накопления
в природе этого патогена. Через несколько часов после дачн корма
с зараженной плантации на выкормках начиналась массовая гибель
шелковичных червей, вызванная бациллярной интоксикацией.
Оригинальные штаммы бациллы Ишиваты были сохранены и всесторонне
изучены в самой Японии, а позже и за ее пределами, где
раннне публикации долгое время оставались неизвестными. Даже
после ознакомления со статьями Аоки и Чигасаки, вышедшими на
немецком языке, находка Ишиваты не вызвала особого ин т ер еса .
Предполагалось, что новое заболевание — лишь частный случай из
сферы специфических особенностей японского шелководства.
Независимо от этого открытия, в 1911 г. Е. Берлинер опубликовал
в Германии предварительное сообщение относительно болезни
гусениц мельничной огневки (Ephestia kuhniella Zell.), завезенной
в Западную Европу из Северной Америки. Болезнь этого амбарного
вредителя вызывалась спорообразующей бактерией, которую Берлинер
позже назвал по имени быв. админ, области Германии Тюрингии,
где она была открыта, Bacillus thuringiensis (1915). Штаммы Берлинера
были утеряны, но в 1927 г. немецкий ученый О. Маттес вновь изолировал
эту бактерию и безуспешно пытался использовать ее культуру
в борьбе с амбарными вредителями.

В 50-х годах во Франции в департаменте Гар, колыбели французского
шелководства, сотрудники парижского Института Пгаера Туманов
и Ваго (1S51) выделили разновидности бактерии тюрингиепзис
«алее», а последующая экспедиция — штамм «андуз», названные так по
наименованию близлежащих городов.
Именно здесь, в районе Алеса, в местечке Понт-Жиск, в прошлом столетии
Пастер проводил свои исследования и писал книгу о болезнях шелковичных
червей. Сопоставление этих фактов побудило ученых заново изучить
труды Пастера, так как возникло предположение, что изображенные
в его книге «вибрионы с ядрами» из кишечника фляшерий-
ных гусениц могли оказаться местной разновидностью тюрингиензиса.
Вероятность такого предположения возрастала в связи с тем, что в трудах Пастера помещен цветной рисунок мертвой гусеницы, внешний вид которой типичен для острых
токсикозов. По словам Пастера, такие гусеницы после гибели выглядели,
как живые (рис. 15).
После того как в 20-х годах текущего столетия эпизоотия «белых
мертвецов» распространилась в Италии, Э. Ф. Поярков (САНИИШ)
высказал мнение, что внешний вид трупов шелковичных червей,
погибшпх в одном из районов Узбекской ССР, также имел много обшего
с признаками этой болезни. В 30-х годах в разных районах республики
Е. Н.Михайлову приходилось
наблюдать на выкормках
признаки острого токсикоза и
выделять из трупов гусениц спо-
рсобраэующих бактерий. За неимением
в то время других прототипов
он идентифицировал их
то как Вас. cereus, то как Вас.
sotto. Много позже Э. К. Афри-
кян (1973) сообщил, что в трупах
гусениц и коконах карапа-
чах из Закавказья и Средней
Азии нередко присутствуют бактерии
из группы цереус тюрин-
гиензис. К этому времени в
УзССР была уже собрана большая
коллекция разновидностей
тюрингиензиса — несколько со^


штаммов, выделенных у ту-
Ж • тового шелкопряда и полевых
. вредителей и предназначенных
в качестве продуцентов
для биоинсектицидов (Михайлов,
Сухачева и др., 1971),
выпускаемых отечественной
промышленностью (Михайлов,
Троицкая, Плужников, 1974).
Систематика энтомопатоген-
ных кристаллофоров. Изучая
выделенную им бактерию, Берлинер обнаружил в клетках спорулирую-
щей культуры своеобразные включения. Он назвал их Restkorper (остаточные
тельца) предполагая, что они образуются из остаточной части
протопласта бактериальной клетки, не вошедшей в состав споры.
Спустя много лет Хенней (1953) вновь обратил внимание на ромбовидные
кристаллоподобные включения, формирующиеся во время споруля-
ции и появляющиеся затем в культуре бактерий в свободном состоянии,
наряду со зрелыми спорами. Эги образования получили название
параспоральных (греч. рага — около) криста л лоподобаых включений,
а для краткости — просто кристаллов (рис. 16—18); бактерий же
с подобными включениями стали называть криипаллофорами (греч.
phoris — носитель, несущий).
В 50-х годах штаммы тюриигнензиса рассматривали как разновидность
попсеместно распространенной, в том числе в поверхностном
почвенном слое, Вас. cereus Frankland end Franldand. Э. А. Штейн-
хауз (1954) писал, что культурально тюрингиензис действительно
идентичен цереусу, однако отличается от последнего параспоральными
кристаллоподобными включениями и патогенностью для насекомых.
Бактерию Берлинера все чаще стали рассматривать как самостоятель-

нын вид, а ее многочисленные
изоляты с основными признаками
Вас. thuringiensis Berliner—Mattes,
выделенные из различных
насекомых и на разных континентах,
но отличающиеся некоторыми
культуральными, биохимическими и
серологическими особенностями, были
признаны вариететами (разновидностями)
тюрингиензиса: Вас.
thuringiensis var alesti, Вас. thuringiensis
var. Sotto, Вас. thuringiensis
var. golleria и т. д. (Криг,
1961). Вариетет тюрингиензиса,
выделенный и описанный Берлинером
и Маттесом, стали именовать
Вас. thuringiensis var. berliner,
а еще чаще Вас. thuringiensis
var. thuringiensis, подчеркивая
этим его положение как видового
прототипа (оригинала, первоначального
образца).
Для систематизации вариететов по их отличительным признакам
был предложен ряд схем. Наиболее полно необходимые таксономи-
ческ'.е критерии учтены в систематике, разработанной в Институте
Пастера в Париже А. Бонфуа и де Баржак (1963). Основу систематического
распределения составили восемь главных групп тюрингиензиса,
различающихся по серологическим признакам.
Бактерия тюрингиензис характеризуется наличием жгутиков с присущими
им антигенными свойствами.
Жгутиковый, или -------
флагеллярный антиген бактериальных
«ресничек», он
же //-антиген (аш-антиген),
отличен от О-антигена или
соматического, который состоит
из антигенов всей клетки.
Кролик иммунизируется
//-антигеном, ц сыворотка его
крови приобретает способность
агглютинировать, склеивать
бактерии в хлопья.
Реакция эта может быть получена
с тем большим разведением
сыворотки, чем ближе
в систематическом отношении
исследуемый штамм к штамму,
взятому для иммунизации кро-
лика (рис. 19). Реакция макроскопической агглютинации ставится в
тонких, укороченных агглюгинационных пробирках, содержащих в
последовательном разведении сыворотку крови иммунизированного
кролика; такую сыворотку называют антисьшороткой к тому варие-
тету, которым он иммунизирован. Степень родства (систематической
близости) исследуемого шгамма со штаммом, использованным для
приготовления антисыворотки, устанавливают по титру наибольшего
разведения последней, при котором сохраняется ее способность к
агглютинации бактерий.
Реакция агглютинации с Я-антигеном не дает возможности различать
очень близкие в серологическом отношении вариететы. Например,
вариететы сотто и дендролимус Бонфуа и де Баржак отнесли
к одному и тому же серотипу, а несовпадение их характеристик
по способности сбраживать сахарозу и целлобиозу (сотто ± ; дендроли-
мусТ) рассматривалось ими как биотипические различия в пределах
серотипа; биотип—популяция, отличающаяся от остальных представителей
вида отдельными физиологическими признаками. Они обозначили
их символами биотипов: 4а и 4в. То же самое произошло с варие-
тетами субтоксикус и энтомоцидус, отнесенными к одному и тому же
шестому серотипу и помеченными как его биотипы.
Норрис (1964) исследовал с помощью электрофореза в геле вариа-
бильность структуры эстеразы («типы эстераз») у вариететов тюрингиензиса.
Эта обширная группа ферментов в современной номенклатуре
носит название гидролаз эфиров карбонатных кислот, которое
характеризует сущность их катализирующей функции. Они широко
распространены в мире животных существ, в том числе микроорганизмов.
Норрис включил этот признак различия вариететов в схему Бонфуа
и де Баржак. Наконец А. М. Хеймпель (1967) усложнил всю схему,
введя в нее в качестве признака состав токсинов, образуемых
вариететами, и их патогенность для типового подопытного насекомого
тутового шелкопряда. Позже схему Бонфуа и де Баржак дополнили
другие исследователи (Булла и др., 1975): вариететы KurstaKi (Н-се-
ротип За, Зв), canadensis (5а, 5с), entomocidus — Iimassol (6), Darmstadicusis
(10), Toumanoffi (11), Thompsoni (12).
Кроме того, зарегистрированы следующие вариететы и штаммы
тюрингиензиса: amuscatoxicus, anagastae, pacificus, shvetsova и др.
Ключ для определения вариететов тюрингиензиса приведен в табл. 2.
Г. А. Плужников (1975) разработал метод получения преципити-
рующих моносывороток на основе О-антигена, который в реакциях
преципитации в геле реагирует только со специфическим компонентом
в антигенном комплексе каждого из сопоставляемых вариететов.
Полученные моносывороткн позволили серологически четко дифференцировать
отдельные вариететы, которые в схеме Бонфуа и де Баржак
рассматривались как культуральные биотипы одного и того же серотипа.
Этот метод помог показать серологическую обособленность нового
вариетета, выделенного в Узбекистане и описанного под названием
Вас. thuringiensis var. asiae—mediae, nov. var. (Троицкая, Михайлов,
Плужников, 1972).

Вейзер (1966) полагает, что у каждого вариетета тюрингиензиса

свой узкий ареал и они чаще всего поражают определенный видовой
состав насекомых. Возможно, что такая приуроченность в свое
время участвовала в формировании вариететов, однако исходная
локализация к настоящему времени оказалась в значительной степени
стертой под влиянием товарного обмена и других средств переноса
инфекции. Наш опыт показал, что в Узбекистане на выкормках тутового
шелкопряда и у вредителей сельскохозяйственных культур —
подгрызающих совок, капустной белянки, яблонной плодожорки
и др.— встречаются различные вариететы тюрингиензиса, в том числе
галлерия, алести, сотто и др. О космополитизме вариететов свидетельствует
также ряд японских публикаций (Оба, Аизава, 1978).
Токсины как фактор патогенности. Токсины бактерий— производные
нормального обмена веществ, белки с высокой молекулярной
массой и четко выраженными антигенными свойствами. Их принято
делить на экзотоксины и эндотоксины.
Экзотоксины выделяются микробами во внешнюю среду. Как их
получают? Продуценты культивируют на жидких питательных средах,
отделяют токсины от микробов: пропуская через бактериологические
фильтры, освобождают фильтр от балластных веществ питательной
среды, микробных метаболитов и т. п. Из фильтрата путем адсорбции
или ультрафильтрации осаждают экзотоксины с последующим высушиванием
в вакууме. Часто экзотоксин представляет собой смесь двух
или нескольких модификаций (обычно обозначаемых буквами алфавита),
которые дифференцируют с помощью ультрацентрифугирования,
повышения скорости диффузии или электрофореза в соответствии с размерами
молекул и их молекулярной массой.
Выделение экзотоксина сквозь неповрежденную оболочку жизнедеятельной
клетки может происходить посредством диализа. Возникало
сомнение: возможно ли, чтобы через клеточные мембраны проходили
подобные крупномолекулярные вещества; выяснилось, однако,
что в клетке микроба присутствует не токсин, а его предшественник
— протоксин, с более мелкой молекулярной структурой. Оказываясь
в организме насекомого или во внешней среде, протоксин под
действием ферментов самого микроба или ферментов заражаемого
организма превращается в токсин. При этом под влиянием ферментации
у протоксина освобождаются заблокированные радикалы, которые
представляют собой, по существу, инструмент токсического поражения.
У бактерии тюрингиензис выделение нативного токсина параспо-
ральных включений не требует таких сложных операций, так как он
освобождается спорообразующей клеткой вместе со сформированной
спорой и оказывается в свободном состоянии в культуральной жидкости
в виде кристаллоподобных телец.
Эндотоксины— структурный компонент микробной клетки, в окружающую
среду поступают только после гибели и разрушения клеток.
Получают их посредством экстрагфрования. Эндотоксин состоит
из белка, полисахаридной и липидной иракций (этот комплекс называют
полным антигеном Буавена). Две первые фракции прочно связаны
друг с другом и обнаруживаются только после гидролиза всего комплекса.
Хотя этот комплекс обладает отчетливым антигенным свойством,
токсичность его преимущественно обусловлена участием в нем липида
А. Полисахарид, сам по себе, нетоксичен, а белки и липид В менее
токсичны, чем липид А.
Наличие экзо- и эндотоксинов и их особенности связаны с видовой
принадлежностью микроба; количественное же выражение токсинообразовательной
способности, вплоть до полной ее утраты, является
особенностью штамма, и проявление ее зависит от условий жизнедеятельности
микроба.
Экзо- и эндотоксины не равнозначны по токсическим свойствам
и по ряду основных особенностей. Экзотоксины обладают значительно
большей ядовитостью; смертельная доза их на несколько порядков
больше , чем у эндотоксинов. Для проявления действия экзотоксинов
необходим инкубационный период; эндотоксины же действуют сразу
же после введения их в организм. Экзотоксинам присуща специфическая
приуроченность к органам и тканям; некоторые избирательно
поражают нервные клетки — нейротоксины; другие вызывают омертвение
тканей — некротоксины, существуют токсины, растворяющие
клетки - цитолизирующие, а также свертывающие белки физиологических
жидкостей — коагулирующие и т. д. Эндотоксины, чаще всего,
признаками специализации не обладают.
Экзотоксины термолабильны, разрушаются при 60—8 0 °С в течение
менее четверти часа. Эндотоксины разрушаются только при длительном
кипячении или более высокой температуре. Такие же различия
в степени стабильности тех и других токсинов наблюдаются и в отношении
действия на них ультрафиолетовых лучей. Кислая и резкощелочная
реакции разрушают те и другие токсины. Влияние на токсины
попеременного замораживания и оттаивания незначительно,
а высушивание и, особенно, лиофнлизация (сушка при низкой температуре
под вакуумом), позволяют длительно сохранять их исходную
активность.
Ферменты патогенности. Токсины — не единственный фактор развития
болезни. Размножаясь в теле насекомого, бактерии при участии
своего интенсивно функционирующего ферментативного аппарата
взаимодействуют с процессом обмена веществ в клетках инфицированного
организма; при этом ферменты способны не только нарушать
течение биохимических процессов в оккупированном организме,
но и вызывать нарушение целостности клеточных структур, участвовать
в их разрушении. Нередко их условно выделяют, называя ферментами
патогенности.
Ферменты патогенности, так же как токсины, являются белками;
те и другие способны проявлять свое действие в весьма малых дозах
после сравнительно длительного бессимптомного периода. Действие
ферментов, так же как токсинов, осуществляется при участии активных
центров молекулы, которые представлены в ней особой конфигурацией
пространственного расположения отдельных участков поли-
пептидной цепи. И все-таки отождествлять оба этих фактора патогенности
бактерий не следует. Прежде всего они отличаются рядом специфических
черт участия в патогенезе инфекционных заболеваний.
Так, токсины принято считать основным фактором пагогеннссти, дейст-
вне их носит детерминирующий характер, определяющий главные
черты проявления болезни. Ферменты же чаще Есего служат сопутствующим
фактором в патогенезе, они ответственны за проявление
отдельных симптомов заболевания.
В развитии болезни участвует весь комплекс факторов патогенности:
токсины, ферменты патогенности, а также некоторые продукты
метаболизма патогена и продукты распада клеток самого пораженного
организма. Доля участия этих факторов варьирует в зависимости
от природы болезнетворного организма, но соотношение этих факторов
может оказаться неравнозначным у разных штаммов одного и того же
вида или разновидности возбудителя; у одних с большей определенностью
в ходе инфекции проявит себя острый токсикоз, у других —
ферменты патогенности или другие сопутствующие факторы патогенеза.
Возбудитель бациллярного токсикоза тутового шелкопряда —
Вас. thuringiensis обладает полным набором факторов патогенности:
токсинами параспоральных кристаллов, ферментами патогенности
(лецитиназой С и некоторыми другими), болезнетворными метаболитами
в виде термостабильного токсина. По современным представлениям
Хеймпель был не прав, когда факторы патогенности в предложенной
им систематике бактерии тюрингиензис ошибочно назвал экзо- либо
эндотоксинами, обозначив их буквами греческого алфавита: например,
б-endotoxin (дельта-эндотоксин) — токсин параспоральных кристаллов;
a-exotoxin (альфа-экзотоксин) — фермент патогенности лецити-
наза С; P-exotoxin (бета-экзотоксин) — фактор патогенности, термостабильный
метаболит аденозинмонофосфат и т. д.; по существу называться
токсином могут только параспоральные кристаллы.
Параспоральные кристаллы и их образование. По форме кристаллы
представляют собой правильный тетрагональный октаэдр, проекция
которого на плоскость имеет очертание ромба; именно так выглядят
эти кристаллы на окрашенных постоянных препаратах под световым
микроскопом. Электронный микроскоп позволил получить их изображение,
увеличенное в несколько десятков тысяч раз (Шивели, 1974).
Они оказались бипирамидой на общем основании, с вершинами, обращенными
в, противоположные стороны. Поверхность кристалла покрыта
рельефными бороздками, расположенными параллельно основа-

нию бипирамиды, на одинаковом расстоянии друг от друга (рис. 20).
Руководствуясь рентгеноструктурным анализом, Холмс и Монро
(1965) построили модель молекулярного строения этего кристалла.
Изучалась так же форма структурных субъединиц, из которых слсжен
кристалл, но выводы авторов здесь оказались противоречивыми.
Образование кристалла непосредственно связано со спорообразованием.
Электронная микроскопия позволила проследить за процессом
споруляции, начиная с появления так называемой примордиальной
(зачаточной) споры. Местом ее образования служит участок в цитоплазме
бактериальной клетки, где концентрируется дезоксирибонуклеиновая
кислота. Примордиальная спора путем инвагинации
(впячивания вовнутрь) цитоплазматической мембраны бактерии образует
внешнюю оболочку споры — экзоспорий. Затем из плазмы самой
споры формируется наружная оболочка споры (экзина), а под ней —
внутренняя оболочка (интина). Протоплазматическая сердцевина
споры окружена корковым слоем — структурой, соответствующей
цитоплазматической мембране бактериальной клетки и граничащей
непосредственно с интиной.
После образования споры тело вегетативной клетки бактерии отмирает;
остаток ядерного вещества, цитоплазмы и клеточной оболочки
бактерии, от которой освобождается сформированная спора, становится
отмершим спорангием, внутренняя поверхность которого граничит
с экзоспорием — внешней оболочкой споры.
Образование кристалла начинается в начале споруляции с маленькой
преломляющей свет гранулы, появляющейся в процессе образования
экзоспория. У всех вариететов
кристаллы формируются
внутри спорангия на
поверхности экзоспория (рис.
21). После завершения формирования
споры и кристалла
стенки спорангия разрушаются,
а споры и кристаллы
освобождаются и отдельно
поступают в культуральную
жидкость. Исключение составляет
вариетет финитимус,
у которого споры и кристаллы
после разрушения стенки
спорангия не отделяются друг
от друга; это связано с тем,
что возникновение кристалла
и его формирование происходит
в отличие от других вариететов не на поверхности экзоспория,
а внутри, в непосредственном соприкосновении со спорой.
Химическая природа белка кристалла очень похожа на белок
экзоспория и имеет с ним общие антигенные детерминанты (молекулы
антигена, соединяющиеся с активным центром гомологичного антитела).
Серологические исследования антисывороток к антигену кри-

сталлов показали, что белок кристаллов впервые обнаруживается
этими реакциями одновременно с появлением экзоспория и, следовательно,
начало образования кристаллов соответствует примордиальному
этапу споруляции. Одним из самых первых явлений, предшествующих
началу споруляции, является синтез бактериальной клеткой
комплекса ферментов, с деятельностью которых происходит преобразование
белка цитоплазмы, необходимое для построения споры; ферменты
бактериальной клетки непосредственно участвуют в синтезе
белка экзоспория. Предполагают, что параспоральные кристаллы
вариететов тюрингиензиса образуются в результате перепроизводства
белка экзоспория, вследствие нарушения процессов, управляющих
синтезом этих молекул во время спорообразования. Высказывалось
также предположение, что кристаллообразование связано с присутствием
в бактерии «умеренного» фага, удаление которого лишает
тюрингиензис способности образовывать кристаллы. Последнее
десятилетие у тюрингиензиса интенсивно изучаются плазмиды — вне-
хромосомные дву нитчатые кольцевидные молекулы ДНК, встречающиеся
в цитоплазме бактерий, наряду с единственной у них хромосомой.
Фрагменты хромосомной ДНК могут быть включены в плазмиду,
а последняя — «инфицировать» ими другую бактерию, осуществив
перенос связанного с ним признака. Роль плазмид в генной
обусловленности кристаллообразования представляет большой интерес
и широко исследуется у разных вариететов тюрингиензиса (Ии-
зуки и др., 1981, 1982).
Кристаллы не являются неотъемлемой частью спорообразования
у бактерии тюрингиензис; связь эта может быть нарушена и в том
числе — мутацией, в результате чего споры образуются без сопровождения
кристаллов. По всей видимости, подобные случаи более
вероятны для штаммов и вариететов с менее стойким кристаллообразовательным
шунтом (ветвью) белкового синтеза у спорулирующей
клетки.
Инсектицидные свойства параспоральных кристаллов. Берлинер
и Маттес не предполагали, что между параспоральными и энтомопато-
генными свойствами изучаемых ими бактерий есть связь. Много лет
спустя такое предположение было высказано Хеннеем (1953), а Ангус
(1945) подтвердил его, показав зависимость между токсичностью спо-
рулирующих культур этой бактерии и образованием кристаллов.
Он сравнивал действие на шелковичных червей смеси спор и кристаллов,
спор, отделенных от кристаллов, щелочного экстракта, приготовленного
из спор и кристаллов, и установил, что параспоральные
включения — это в основном растворимое в щелочах белковое вещество,
токсичное для гусениц некоторых чешуекрылых.
Ангус обнаружил, что отмытые кристаллы, введенные в кровь
шелковичных червей, не токсичны. Содержание же кишечника после
кормления гусениц кристаллами, впрыснутое в гемолимфу, оказалось
токсичным. Кроме того, автор растворял кристаллы в щелочи
и осаждал белок из раствора нейтрализацией, пытаясь воспроизвести
условия, которые действуют на кристаллы в кишечнике шелковичных
червей. Полученный токсин был сильно ядовит для восприимчивых
насекомых: ЛД.П для шелковичного червя составляла 1 мкг/г массы
гусеницы. Ангус обнаружил, что восприимчивость насекомого к токсину
параспоральных включений зависит от концентрации щелочей
в содержимом средней кишки. На влияние щелочности указывали
и наблюдения Туманова и Ваго (1952). Они нашли, что голодавшие
гусеницы (с повышенным pH кишечного сока) чувствительнее к токсину,
чем те, которые поедали листья шелковицы. Чувствительность
к токсину сильнее у насекомых с высоким уровнем щелочности кишечного
сока — pH не ниже 9. По-видимому, сама по себе щелочная реакция
кишечного сока — не единственное условие, необходимое для того,
чтобы белок кристаллов стал токсичным. Ряд авторов стремились
выяснить роль ферментативных процессов в средней кишке, при участии
которых протоксин параспоральных включений превращается в активного
агента кишечной интоксикации. Лекадэ и Мартуре (1962,
1965) выделили из рвотного содержания хилуса капустной белянки
(из средней кишки) комплекс пищеварительных ферментов. Кристаллы
были растворены этим препаратом и лизат очищен диализом. Токсичность
диализата при скармливании и впрыскивании в кровь оказалась
выше, чем у недиализированного материала или у кристаллов,
растворенных в щелочи. Протеолитические ферменты капустной белянки
и тутового шелкопряда состоят из двух протеазс оптимумом действия
pH 9,5—10,7; это соответствует реакции кишечного сока во время
проявления гусеницами наибольшей чувствительности к токсину.
Протеазы гусениц гидролизуют кристаллы и освобождают ряд растворимых
белковых и пептидных соединений.
Интоксикация при естественной инфекции проявляется стремительно
(Туманов, Ваго, Гладилин, 1954). Первый симптом поражения
— прекращение питания, сопровождающееся затяжным или острым
расстройством. При затяжном токсикозе, вслед за внезапным
прекращением питания, повышается щелочность гемолимфы, понижается
pH кишечного сока, возрастает проницаемость стенки средней
кишки. Нарушение избирательной проницаемости неповрежденной
стенки кишечника влечет за собой возникновение нейротропного поражения
в форме приступа вялости, частичного, а затем и генерализованного
паралича. Физиологические нарушения сопровождаются
увеличением численности кишечных бактерий; в развитии болезни
принимают участие вегетативные особи тюрингиензис после прорастания
их спор в кишечнике. Клетки эпителия отмирают, бактерии проникают
в кровь и течение болезни приобретает токсико-септический
характер.
В острых случаях токсикоза гибель наступает раньше некротического
разрушения стенки кишечника и проникновения бактерий
в кровь. По наблюдениям Хеймпеля и Ангуса (1958), у шелковичного
червя через 20—30 мин после заглатывания кристаллов вариетета
сотто наступает паралич средней кишки, а спустя 2 ч — общий паралич
и гибель.
Развитие токсико-септических или остротоксических синдромов
вависит от вариетета бактерии тюрингиензис и от степени восприимчивости
насекомого к факторам патогенности, обусловленной его
видовой принадлежностью. Так, при заражении вариететами сотто
и алести гусениц капустной белянки, коконопряда и некоторых других
бабочек, после начального симптома — прекращения питания
последующие влияния — изменение реакции гемолимфы, частичный
и общий паралич — не наблюдались; объясняли это более значительными
буферными свойствами гемолимфы у этих насекомых. Эти вариететы
вызывают у них затяжной характер заболевания. Кристаллы
не всех вариететов и не для всех видов насекомых одинаково токсичны.
Основной продуцент ряда инсектицидных биопрепаратов — вариетет
тюрингиензис, для гусениц тутового шелкопряда мало токсичен или
совсем непатогенен, в то время как вариететы сотто и алести для них
очень опасны.
Получение очищенного белка параспоральных включений — достаточно
сложная и не всегда выполнимая задача. Ангус (1954) впервые
выделил из спорулирующей культуры энтомоцидный белок кристаллов;
болезнетворные свойства этого белка сохранялись в течение
ряда лет. Хеймпель и Ангус (1958) убедились, что кристаллы вариетета
сотто, хранившиеся в темном месте при 3°С, оказались токсичными
для шелковичных червей даже по истечении 10 лет. Белок кристаллов
теряет токсичность в результате денатурации. Он термолабилен
и перестает быть токсичным при нагревании до 55°С в течение
15 минут. В то же время водная взвесь не обработанных щелочью
интактных (не измененных) кристаллов способна сохранять токсичность
после нагревания при 80°С в течение часа. Кристаллы не утрачивают
инсектицидных свойств в результате облучения их ультрафиолетовыми
лучами бактерицидной лампы в течение двухчасовой
экспозиции (Кентвелл, 1967). Примерно такие же результаты получены
при воздействии на кристаллы солнечных лучей (Африкян, 1973).
Споры повреждаются от ультрафиолетового облучения легче, чем
кристаллы. Последние менее стойки к воздействию химических веществ:
для разрушения кристаллов щелочью нужно в несколько десятков
раз меньшую концентрацию и во много раз меньшую экспозицию,
чем для разрушения спор.
Среди интенсивно изучаемых энтомопатогенных организмов бактерия
тюрингиензис привлекла к себе наибольшее внимание в качестве
биологического инсектицида, высокая эффективность которого
продемонстрирована на многих вредителях и в разных природных
условиях. В промышленных препаратах чаще всего используют естественную
смесь спор и кристаллов, значительно реже — препараты
токсического белка. Каждой марке препарата соответствует в качестве
продуцента определенный вариетет бактерии тюрингиензис: энтобак-
терину (СССР) — вар. галлериа, турициду (США) — вар. берлинер
и т. д. Широкое и не везде контролируемое с точки зрения интересов
шелководства применение этих препаратов может представлять для
выкормок шелкопряда достаточно серьезную опасность. Поэтому
в Японии введены определенные ограничения на использование биопрепаратов
в сельском хозяйстве.
Инсектицидное вещество параспоральных кристаллов чаще всего
именуют эндотоксином (дельта-эндотоксин А. М. Хеймпеля, 1967).
Между тем, как уже отмечалось, кристаллы эти не являются таким компонентом
цитоплазмы бактериальной клетки, который неразрывно
связан с ней до момента ее разрушения. Они формируются в бактерии
во время споруляции, прижизненно элиминируются (исключаются)
из цитоплазмы, чтобы затем, вместе со спорами, оказаться во внешней
среде. На этом основании параспоральные кристаллы следовало бы
отнести не к эндо-, а к экзотоксинам.
Лецитиназа бактерии тюрингиензис. После того как в ряде исследований
было показано, что токсин возбудителя газовой гангрены
человека Вас. perfringens представляет собой лецитиназу С, этому
ферменту было уделено особое внимание. Лецитиназа или фосфолипаза
— фермент, катализирующий гидролитическсе расщепление
эфирных связей жирной и фосфорной кислот в лецитинах. В зависимости
от того, на какую из четырех эфирных связей в молекуле лецитина
направлено действие этого фермента, различают лецитиназы
А, В, С, Д. Продукты, образующиеся при гидролизе лецитина— ди-
глецериды и фосфохолин, не обладают токсическими свойствами.
Болезнетворное свойство этого Фермента патогенности связано с разрушением
им незаменимых фосфолипидов в тканях поражаемого организма.
Обеспечивая гидролитическое расщепление эфирных связей в молекулах
фосфолипидов (летицина) и высвобождая жирные кислоты,
фермент лецитиназа С разрушает клеточные мембраны и нарушает
связанные с ним процессы жизнедеятельности клеток.
Активность фермента устанавливают, высевая культуру исследуемой
бактерии на мясо-пептонный агар, пропитанный эмульгированным
желтком куриного яйца: под действием лецитиназы бактерий
вокруг выросших колоний образуется просветленная зона с радужным
ореолом. Лецитиназа С обнаружена во многих тканях животных,
в змеином яде, в культурной жидкости многих бактерий, в том числе
энтомопатогенных и не только спорообразующих (бацилл), но и таких
известных возбудителей септицемии у насекомых, как чудесная
(В. prodigiosum) и синегнойная (В. aeruginosa) бактерии. Туманов
и Ваго (1951) выделили из гусениц тутового шелкопряда в качестве
возбудителя фляшерии новый вариетет бациллус тюрингиензис, которую
в те годы еще не отличали от цереус и потому они называли
ее Вас. cereus var. alesti. Туманов (1955) показал, что фактором патогенности
этой спорообразующей бактерии является фермент лецитиназа
типа С (рис. 22); она оказалась очень токсичной при впрыскивании
в гемолимфу шелковичных червей, но очень слабо токснчной
при введении в кишечник. Затем Хеймпель и Ангус (1958) на основании
результатов опытов пришли к выводу, что патогенность сотто-бациллы
Ишиваты тоже связана с активностью этого фермента, По>же было уста-
тановлено, что лецитиназа С, как любой другой метаболит, образуется
в зависимости от индивидуальных особенностей штамма бактерии
и, в известной степени, от условий его культивирования. Не все
вариететы тюрингиензиса характеризуются фосфолипазной активностью.
Это послужило поводом к тому, что Хеймпель в классификации
вариететов тюрингиензиса (1967) в качестве систематического
признака учитывал токсинообразовательную способность. Он раз-

личал бактерии, образующие и необразующие альфа-экзотоксин (фос-
фолипазу С): к необразующим он отнес вариететы галлериа, анагаста,
энтомоцидус и субтоксикус (Хеймпель, 1965). По данным Э. Ф. Афри-
кяна (1973), все штаммы кристаллофоров, отнесенных им к новому
серотипу и вариетету кавказикус, характеризуются четко выраженной
фосфолипазной активностью. Выделенный в Узбекистане новый вариетет
тюрингиензиса — азиа-медиа слабо проявляет лецитиназную
активность или вовсе ее не обнаруживает (Троицкая и др., 1972).
Лецитиназа С (фосфолипаза С) — термолабильный фермент, с оптимальной
для своего действия реакцией среды — pH 6,S—7,5. Хеймпель
нашел, что фосфолипаза С, выделяемая бактериями — кристалло-
форами губительна для многих насекомых, в частности для тех, у которых
величина pH кишечного сока (7—8) близка к нейтральной.
У шелковичных червей реакция содержимого средней кишки обычно
более щелочная, однако фосфолипаза С может оказывать на них болезнетворное
действие; при поступлении в кишечник в достаточном
количестве она вызывает повреждение эпителиальных клеток и способствует
проявлению некротической деятельности со стороны бактериальной
флоры кишечника. Однако наибольшей результативности
этот фермент патогенности достигает, по-видимому, в сочетании с токсикозом,
вызванным кристаллами тюрингиензиса.
А. М. Хеймпель (1965) обнаружил в культуральной жидкости
бактерии тюрингиензис шестого серотипа (субтоксикус и энтомоцидус)
неидентифицированный фермент патогенности, вызывающий осветление
желточного агара, который он обозначил как гамма-экзотоксин.
Позже им был найден лабильный экзотоксин в образцах тури-
цида — фирменного препарата, изготовленного на основе вариетета
берлинер (вар. тюрингиензис), производимого промышленностью США
(1966). Экстрагированный водой, он был токсичен для личинок пилильщика.
Анализ показал присутствие в его составе свободных аминокислот
и гептидов; какие именно из них оказывали болезнетворное
и летальное действие на подопытных насекомых, установить не удалось.
Не выяснено также, не было ли артефактом экстрагированное
вещество, оказавшееся губительным для насекомых, и не образовалось
ли оно в процессе ферментации при производстве препарата тури-
цида.
Термостабильный токсин бактерии тюрингиензис. Мак-Коннели
и Ричардс (1959) установили, что фильтрат автоклавированной культуры
вариетета берлинер содержит устойчивый к нагреванию токсин,
губительный не только для личинок мясной мухи, но и для других
насекомых. Он получил название мушиного или термостабильного
токсина. Бюржерон и де Баржак (1960) нашли, что для накопления
термостабильного тсксина пригодны обычные бактериологические
среды; обнаруживается он начиная с восьмого/jaca культивирования
бактерий при 30°С и количество его возрастает в течение логарифмической
(наиболее активной) фазы роста бактерий, достигая максимальной
концентрации в культуральной жидкости через сутки — перед
началом образования спор и кристаллов. Этот экзотоксин растворим
в воде и культуральной жидкости и выдерживает при автоклавнро-
вании температуру 120° С в течение 10 мин. Видовой спектр действия
термостабильного токсина насекомых шире, чем токсина параспоральных
кристаллов. Он патогенен для представителей отрядов двукрылых,
чешуекрылых, перепончатокрылых, жуков, прыгающих прямокрылых
и тараканов. Сведения о способности вариететов бактерии тюрингиензис
образовывать термсстабильный токсин часто противоречивы; известно,
что обнаружен он не у всех серотипов. Хе£мгель, например,
помимо вариетета берлинер, у которого термостабильный токсин был
выявлен рядом авторов, называет в качестве его продуцента вариететы
галлериа и аицава; у шестого серотипа этого токсина нет, а вариететы
сотто и алести в этом плане им вообще не рассматриваются.
В. Ф. Рудюк (1967) предполагал, что способность образовывать термостабильный
токсин — признак, присущий не столько вариетету,
сколько штамму.
М. В. Мод-Соллех с соавторами (1980) поставили перед собой задачу
внести ясность в разноречивые сведения относительно зависимости
инсектицидных свойств экзотоксина бактерии тюрингиензис
от вариететной принадлежности продуцента, йот субстрата для его размножения,
а применительно к условиям культивирования — от состава
среды ферментации. Сравнивались четыре штамма: вар. берлинер
ХД-27, вар. берлинер ХД-41, вар. толворти ХД-125, вар. дармстадиен-
зис ХД-199; бактерии культивировались на шести средах; для выявления
термостабильного экзотоксина и отделения его от термолабильных
факторов патогенности штаммов супернатант культуральной
жидкости автоклавировали при 125°С в течение 15 или 30 мин. Инсектицидная
активность экзотоксина испытывалась на классическом объекте
для него— личинках домашней мухи и на гусеницах совки ипсилон.
Оказалось, что экзотоксин разных вариететов не равнозначен по
своей активности для разных насекомых: экзотоксин вар. берлинер
ХД-41 поражал личинок мух на 100%, а гусениц совки — на 51%;
на той же среде ферментации экзотоксин толворти поражал личинок
мух на 63,7% и был полностью не активен в отношении совки. Все
четыре штамма продуцировали экзотоксин, но его токсичность была
различной и зависела от штамма бактерии. Автоклавируя суперна-
танты вариететов в течение 15 и 30 мин и испытывая экзотоксин на менее
стойких и более стойких совках, авторам, по их мнению, удалось
показать наличие разных экзотоксинов. Под влиянием автоклавиро-
вания токсичность супернатанта некоторых вариететов снижалась
и только берлинер ХД-27, в отличие от других штаммов этого же вариетета,
продуцировал полноценный термостабильный экзотоксин,
выдерживавший прогрев в течение 30 мин и высоко активный для мух
и совок.
Де Баржак и Дедондер (1965) и з супернатанта культуры вариетета
берлинер выделили нуклеотид, который воспроизводил у насекомых
токсическое поражение, подобное действию автоклавированного
су пер нанта той же культуры. Спектрофотометрический анализ состава
нуклеотида показал наличие у него аденина, рибозы и фосфорозы
в соотношении, близком к 1 : 1 : 1, что соответствовало строению
аденозинмонофссфата.
Мононуклеотид, или собственно нуклеотид (аденозин-3-монофос-
фат),— фосфорный эфир природных гликозидов; образован одной
молекулой аденина — азотистого основания 6-амино-пурина, моносахарида
альфа-рибозы и ортофосфорной кислоты. Аденин и сахар
представлены в нуклеотиде в виде N-гликозида аденозина (рис. 23).
Несмотря на некоторое несовпадение собственных результатов
анализа с данными, полученными другими исследователями, Хеймпель
(1967) считал, что именно аденозинмонофосфат может оказаться
термостабильным токсином бактерии тюрингиензис,так как действие
его проявляется на более широком видовом составе насекомых, чем токсина
параспоральных кристаллов, хотя токсичность его слабее, чем укри-
сталлов в несколько десятков раз. В отличие от кристаллического
токсина термостабильный действует медленно: он вызывает у гусениц
капустной совки потерю аппетита только по истечении первых четырех
суток после его заглатывания, а гибель — на десятый день. Гусеницы
большой восковой моли погибают после инъекции в общую полость


на шестой день, а при скармливании токсина — на 14-й (Ванкова,
1966). В качестве нуклеотида термостабильный токсин способен, по-
видимому нарушать функции АТФ в дыхательном обмене поражаемого
насекомого.
По мнению Лысенко и Кучера (1975), термостабильный токсин
не является токсином в точном понимании природы этого фактора
патогенеза. Термостабильный токсин не белок и его высокая термостабильность
не соответствует свойствам протеинов. У него низкая
молекулярная масса: по данным трех разных экспериментаторов —
в пределах 707—805. Экзотоксин неспособен кристаллизоваться и это
исключает возможность воспользоваться рентгеноструктурным анализом.
Термостабильный экзотоксин, представляющий собой мелкие,
воднорастворимые и легко диализируемые молекулы, выделяемые
в окружающую среду бактерий, правильнее было бы считать метаболитом,
встречающимся у тюрингиензиса с функцией фактора патогенности.
Токсин параспоральных включений и термостабильный токсин
у тех штаммов, где последний обнаружен, способны проявлять синергизм.
Присутствие термостабильного экзотоксина можно установить
не только биологической пробой отфильтрованного и автоклавирован-
ного супернатанта (надосадочная часть жидкости) на чувствительном
насекомом (обычно, на личинках мух), но и спектрофотометрически,
как это было показано де Баржак и др., а позже — И. А. Строевой
(1972).
Токсин вызывает к себе большой интерес как возможнее биологическое
средство борьбы с москитами, комарами, мухами; с последними
прежде всего — на скотных дворах. Обширные данные свидетельствуют
о том, что споры выдерживают пассаж через кишечник мелких
млекопитающих, крупного рогатого скота и птиц. Бактерии из прошедших
через кишечный тракт спор размножаются в няиозе, в котором
накапливается мушиный токсин. Эта особенность спор бактерии и ее
токсина представляет собой эпизоотологическую опаенлеть для выкормок
тутового шелкопряда, размещенных вблизи от скотных дворов
или в освобожденных под выкормку конюшнях, если они были загрязнены
мушиным токсином.