5.5. Диагностика пебрины

Предварительное суждение о зараженности шелкопряда пебриной
может быть составлено по совокупности внешних признаков болезни.
К ним относится, прежде всего, описанная выше общая картина проявления
и развития болезни. Однако окончательный диагноз можно
поставить только на основе микроскопического исследования. На выкормках
такие исследования не всегда могут быть произведены и потому
диагностика по внешним признакам представляет известный
практический интерес.
Пебринозные пятна на кожных покровах шелкопряда. На теле
больных гусениц в промежутках между линьками появляются пебринозные
пятна в виде черных точек. Это результат гистологических
изменений на пораженных ноземой участках эпителиальных клеток
кожных покровов (гиподермы). Точно такие же пятна обнаружены и у
других видов гусениц, у которых нозема поражает клетки кожи
(рис. 98). Так, А. Пайо (1918) описал их у гусениц капустной белянки
(Pieris brassicae L.) при сильном заражении се N. mesnili. Через сутки
после линьки некоторые зараженные клетки гиподермы отделяют по
направлению к кутикуле часть протоплазмы со спорами. Наследующие
сутки эпителиальные клетки, лежащие под этим скоплением спор,
выделяют хитин, так что споры оказываются заключены между двумя
хитинизированными слоями, в том числе — эндокутикулы. По-видимому,
в этом случае секретируют здоровые клетки; через некоторое
время они оказываются изолированными между кутикулой и гиподермой.
По данным Ван-дер-Флааса (1932), кожный покров может
восстанавливаться этим путем и на участках гиподермы, сплошь
состоящих из клеток, переполненных спорами.

На первой стадии формирования пятна сквозь бесцветные слои
кутикулы просвечивает скопление пожелтевших спор, в массе кажущихся
темно-коричневыми. Молодые пятна не имеют резких границ,
кажутся туманными и появляются через двое суток после линьки. На
третий день после линьки пятно становится отчетливо видным. Чем
старше возраст гусениц, тем чаще встречаются пятна на зараженной
выкормке; вместе с тем в старших возрастах пятна появляются позже,
чем в младших. Если пятна образуются вскоре после линьки, то они
довольно долго сохраняют характер молодых туманных пятен; если они
обнаруживаются в конце возраста — перед линькой, то очертания их
почти сразу становятся резкими. По мере старения пятен слой лежащей
под ним кутикулы становится темно-желтым, причина же дегенерации
самих спор не совсем ясна.
Пятна на теле шелкопряда могут быть вызваны, помимо пебрины,
уколами коготков ложных ножек гусениц. Они наблюдаются также при
невыясненных патологических процессах в хитине при заболевании
желтухой (Ван-дер-Флаас), при септицемиях, вызванных некоторыми
бактериями (Михайлов, 1940). В руководстве по шелководству, составленном
специалистами Министерства сельского хозяйства и лесоводства
Японии (1972), отмечается, что пятна могут быть образованы
при мускардине или вследствие укусов насекомых. Поэтому умение
отличать по внешнему виду пебринозные пятна от пятен другого
происхождения очень важно. По данным японских исследователей для
пебрины типичны крупные (слитые из нескольких) или мелкие (одиночные)
черновато-бурые пятна, более темные в центре и светлые
по периферии.
А. А. Тихомиров (1914) тоже отмечал, что светлый ободок не наблюдается
у пятен другого происхождения. Ван-дер-Флаас объясняет
такой вид пятен тем, что лежащие рядом с ними клетки набиты
светлыми, не пожелтевшими спорами; вследствие контраста с темным
участком пятна эти клетки выделяются в виде светлого ободка. Так
как скопления светлых спор в клетках по соседству с пятном может
не быть, то (по его мнению) пятна пебрины могут не иметь этого признака.
У старых пятен окраска по краям более светлая, чем в центре
потому, что в центре цвет пятна определяется потемнением спор
и хитина, тогда как цвет краев зависит только от желтизны хитина.
Наиболее характерны не резкие, туманные пятна; такой вид они приобретают
(по мнению Ван-дер-Флааса) на ранней стадии своего образования,
когда хитин над пожелтевшим скоплением спор еще не изменил
своего вида. Оттенок пятен виден только под лупой с увеличением
не менее, чем в 50 раз, и простым глазом они неразличимы.
Некоторое значение имеет и расположение пятен. Пебринозные
пятна появляются прежде всего на участке вокруг дыхалец, у основания
ложных ножек и в области шипа. Наконец, известную ориентировку
при диагностике по данному признаку дают также сроки
появления пятен. Во втором возрасте пятна, хотя и встречаются, но
редко и только в последние дни. В более ранние сроки пятен на коже
больных червей не бывает. Чем старше возраст червей, тем раньше
появляются пятна. В старших возрастах пятна возникают вскоре
после линьки. Однако выкормка пебринозных гусениц развивается
неравномерно, некоторые из них отстают в развитии и возраст их визуально
не всегда может быть установлен.
Патологоанатомические признаки пебрины. Для практической
диагностики известный интерес представляет внешний вид патологических
изменений внутренних органов, которые можно различить без
оптических средств или через лупу.
Пораженные пебриной участки ткани утолщаются в виде неправильных
по очертанию молочно-белых припухлостей. Эти припухлости
хорошо заметны не только на прозрачных и слабоокрашенных тканях
слюнной и шелкоогделительной желез, но и на буро-фиолетовом фоне
нервных узлов и на темноокрашенпых трахеях. На мышцах видны
продольные молочно-белые утолщения, расположенные межту мышечными
волокнами в виде лодочек, так как нозема размножается вдоль
миофибрил и разжижав г эти участки. Кроме этих признаков, диагностическое
значение имеет внешний вид шелкоотделительной железы.
Если гусеница сильно заражена пебриной, пораженные места шелко-
отделительной железы нетрудно заметить, рассматривая внутренние
органы невооруженным глазом. Над поверхностно прозрачной шелкоотделительной
железы выступают характерные пягна молочного цвета.
Эти выпуклые участки вязком консистенции приобретают у белококонных
пород молочно-белую, а у желтококонных — грязно-желтую
окраску.
Сливаясь, они нередко образуют кольцевидные вздутия, и железа
напоминает бусы. Все это особенно хорошо видно, если железу из
разорванного червя положить на' белое блюдце с прозрачной водой.
На других органах, не прозрачных или не окрашенных в темный цвет
(мальпигиевы сосуды, жировое тело), пораженные места визуально
трудно различимы. Картина крови при пебрнне как диагностический
признак не представляет практического интереса: изменение в составе
гемоцитов и в их цитопатических особенностях проявляются
тогда, когда споры возбудителя пебрины могут быть обнаружены
у шелкопряда в достаточном количестве, в том числе в нативном препарате
из капли гемолимфы. Поэтому микроскопирование окрашенных
препаратов с помощью иммерсионного объектива с большим увеличением
имеет смысл не с диагностической целью, а с задачами научно-
исследовательского характера.
Микроскопические исследования на присутствие спор пебрины.
Обычно исследование на присутствие спор пебрины производится под
микроскопом с 600-кратным увеличением в нативном препарате из
растертого в воде материала: каплю исследуемой жидкости наносят
на .'.редметное стекло и покрывают покровным стеклом (Ковалев,
1951). Исследованию на присутствие спор пебрины могут быть подвергнуты
все стадии жизни тутового шелкопряда, от греныдо бабочки включительно;
объекты исследования могут быть живыми или мертвыми.
Иногда в нативном препарате исследуют гемолимфу, а также отходы
червокормления — скорлупки грены, линочные шкурки, экскременты.
Задача исследования — обнаружить споры, а не вегетативные стадии
паразита. Поэтому, чем позднее взят материал с момента заражения
и чем больше вегетативных стадий ноземы превратилось в споры, тем
легче их обнаружить. Возможности обнаружения спор пебрины в различных
объектах исследования показаны в табл. 8.

Гусениц младших возрастов целиком растирают в ступке с водой
и микроскопируют. В старших возрастах растирают в ступке целого
червя или только кишечник, который более всего заражен. Исследуют
кишечник потому что при микроскопировании целой куколки большое
количество жировых капелек маскирует присутствие спор. Кроме
того, кишечник заражен сильнее и содержит спор больше, чем остальные
органы куколки. Микроскопировать бабочку целесообразнее после
ее естественной смерти и высыхания, чтобы внутриклеточные стадии
паразита закончили цикл развития и превратились в легко обнаруживаемые
под микроскопом споры. Чтобы облегчить микроскопирование,
особенно если исследуются препараты из куколок и бабочек,
к растертому материалу рекомендуется прибавлять слабые раствсры
щелочи, разрушающие жировые тельца. Для более надежного обнаружения
спор, если количество их недостаточно велико, растертый
материал центрифугируют или отстаивают в конических стаканчиках.
Наиболее трудный объект исследования — грена. В ней споры
легче обнаружить только к концу инкубации, с появлением первых
вылупившихся гусениц («разведчиков»). Кроме того, грена менее
удобна для нативного микроскопирования из-за множества желточных
клеток, покрывающих поле зрения препарата. Иногда рекомендуют,
как дополнительное мероприятие по надзору за качеством
грены, микроскопировать скорлупки, остающиеся после инкубации.
Еще Л. Пастер отмечал, что паразит чаще всего обнаруживается в
мертвой, «не ожившей» грене. Это относится прежде всего к бурой
грене, погибающей в начальной стадии пигментации серозной оболочки.
Микроскопирование пустых скорлупок дает менее надежный результат,
так как грена, из которой вылупились гусеницы, заражена
обычно слабо. Кроме того, серозная оболочка и периферийная часть
яйца, составляющие главную массу остатков после вылупления, в случае
благополучного завершения эмбриогенеза, содержат меньше паразитов.
Технические средства и методы микроскопирования, усиливающие
контрастность изображения. Споры возбудителя пебрины в нативном
препарате, подобно многим другим микроорганизмам, прозрачны
в видимом свете и детали их строения оптически почти неразличимы.
Чтобы усилить контрастность изображения в нативном препарате при
пользовании обычным биологическим микроскопом, можно прибегнуть
к различным техническим средствам. В свое время для микроскопирования
спор пчелиной ноземы использовали фонирование препарата
тушью по методу Бурри, предложенного им для обнаружения
бледной спирохеты (трепонемы) — возбудителя сифилиса. Каплю
жидкой китайской тонкодисперсной туши смешивали на предметном
стекле с каплей, содержащей споры ноземы, размазывали краем другого
предметного стекла в виде тонкого мазка, просушивали и микроскопн-
ровали с помощью иммерсионного масляного объектива. Вполезрения
резко вырисовывались овальные контуры неокрашенных спор на темношоколадном
фоне. Несмотря на возможность четкой демонстрации
варьирования величины и формы спор, использование этих препаратов
ограничивалось довольно узкой исследовательской и педагогической
областью. Предложен также способ окраски спор карболовым фуксином,
с фонированнем препарата малахитовой зеленью для последующего
микроскопирования сухим объективом (Х40) (Кириченко,
1977).
Значительно больший практический интерес представляет увеличение
контрастности изображения в нативных препаратах с помощью
оптических средств. К ним относится темнопольная микроскопия.
Эффект темного поля создается боковым освещением специальным
конденсором, который пропускает только краевые, очень косые лучи,
не попадающие в объектив. В результате поле зрения оказывается
темным. Косые лучи проходят через нативный препарат и, встречаясь
со спорами, огибают их; благодаря измененным дифракцией волнам
света, на темном фоне поля зрения становятся видимыми светящиеся,
окруженные ореолом споры. Известный интерес представляет мнкро-
скоппрование в темном поле при исследованиях различных воздействий
на клетку, на ее структурные элементы — ядро, цитоплазму, вакуоли
и т. д. Состояние дисперсности поврежденных белков клетки — степень
их агрегации при этом изменяется и это сказывается на яркости
свечения исследуемого объекта. Еще более щедрым источником информации
о состоянии клеток или микросрганизмсв является люминесцентная
микроскопия. Холодное свечение исследуемого объекта
(люминесценция) возбуждается поглощаемой им световой энергией
при его облучении. Чаще всего в практике люминесцентного микроскопирования
для облучения используют ультрафиолетовые лучи. Объект
исследования на препарате обрабатывают растворами флюоресцирующих
веществ (флюорохромов) и микроскопируют в виде мокрого препарата
под покровным стеклом; люминесцирующий объект в препарате
светится различным светом в темном поле зрения. Достигается
.не только высокая степень контрастности самосветящихся тел, но и возможность
изучения различных жизненных процессов. Люминесцентный
анализ с применением флюорохромов позволяет установить природу
люминесцирующего вещества, его локализацию в клетке и состояние.
Люминесцентная микроскопия существенно расширяет
возможности цито- и гистохимических исследований и экспресс-методов
диагностики; выполняется она люминесцентным микрсскопом
с источником света в виде специального осветителя и набором светофильтров.
Микроскопирование можно вести в отраженном (для непрозрачных
объектов) и проходящем свете; в последнем случае
вместе с люминесцентным эффектом может быть использовано фазовоконтрастное
устройство.
Фазово-контрастная микроскопия. Из всех средств контрастирования
изображения при микроскопировании нативных препаратов
наиболее практически ценным для шелководства оказалось фазовоконтрастное
устройство к биологическому микроскопу.
Контрастность изображения зависит от степени поглощения света
структурными деталями исследуемого объекта. В полупрозрачных
объектах отдельные их участки в разной степени поглощают свет.
В прозрачных объектах свет не поглощается, но, проходя через них,
испытывает смещение фаз колебания световых волн, вызванных неравномерной
толщиной и неодинаковыми показателями преломления
отдельных участков исследуемых структур и окружающей среды.
В результате сдвига фаз световых волн возникает так называемый
фазовый рельеф, но эти оптические явления глаз микроскопнста не
различает. Голландский физик Цернике (1932, 1934) разработал
теорию, а Кёлер и Лоос (1941) сконструировали устройство для превращения
оптическим путем невидимой разности фаз в разность амплитудного
характера. В результате прозрачные объекты воспринимаются
как контрастные. Устройство, участвующее в этих оптических преобразованиях,
состоит из фазовой пластинки с кольцом, которую помещают
под фронтальной линзой биологического микроскопа. При про-

хождении лучей света через фазовое кольцо фаза световой волны
сдвигается и длина ее укорачивается на 1/4.
Фазово-контрастное устройство к биологическому микроскопу состоит
из объективов с фазовым кольцом, конденсора 1 с приспособлением,
позволяющим совместить изображение диафрагмы 2 конденсора
с фазовым кольцом объектива, и вспомогательного микроскопа
3, помогающего выполнению операции по их совмещению (рис. 99).
Этот метод, принятый нашими гренажными заводами, дает возможность
повысить тщательность и достоверность текущего контроля за
ходом микроскопического анализа на пебрину. Благодаря повышенной
резкости изображения, многие из объектов гренажного микроскопирования,
такие, как споры в незрелей куколке или в непикуои-
рованной грене и др., обнаруживаются гораздо легче. Этот прабгр
дает возможность несколько упростить подготовительные операции к
микроскопированию; например, отказаться от инкубирования грены
при ее контрольном анализе на пебрипу.
Существует еще один способ повышения контрастности структур
исследуемого объекта с помощью аноптральной микрсскспии. При
таком способе микроскопирования в объективах устранена возможность
отражения световых лучей от рабочей поверхности линзы, на
которую нанесен светопоглсщающий слой. Изображение, получаемое
с помощью аноптрального объектива, более контрастно, чем при фазовоконтрастном
микроскопировании, очень детально и поле зрения отличается
большей глубиной фокуса —до 2 мкм, т. е. в пять раз больше,
чем у обычного иммерсионного объектива с увеличением в 90 раз.
Микроскопирование постоянных окрашенных препаратов через
иммерсионные объективы. Постоянные препараты приготавливают
в виде мазков ма предметном стекле или микротомированных срезов
с помощью обычной гистологической техники. В них можно видеть
не только споры возбудителя пебрины, но и плазмодии на разных:
этапах их развития; для нативного микроскопирования эти объекты
недоступны. Фиксация материала для гистологических срезов чаще
всего выполняется смесью Шаудина или Бузна, а окраска гистологгт-
ческнх препаратов, так же как мазков, — по Романовскому—Гимзе*
Известно, что у микроспоридий для выявления количества ядер,
участвующих в спорогоним, используют реакцию Фёльгена. Вместе
с тем зрелые споры ноземы с сформированной оболочкой не поддаются:
окраске и их предварительно протравливают. Вейзер (1976) предложил
свсю модификацию метода окраски спор микроспоридий. Чтобы
улучшить проникновение красителя, он применил протравливание
препарата соляной кислотой. Пропись этого метода следующая:
мазок из растертой ткани насекомого наносят на обезжиренное предметное
стекло и фиксируют метиловым спиртом или фламбированием на
пламени горелки. Гидролиз ДНК производится погружением мазка
на 2 мин в нормальный раствор соляной кислоты, нагретой до 60—
100° С. Затем препарат промывают под водопроводной струей и окрашивают
азур-эозином по Романовскому—Гимзе двумя каплями краски,
разведенной в 1 мл дистиллированной воды в течение 10—20 мин,
споласкивают, просушивают и микроскопируют иммерсионным объективом.
Свой метод Вейзер демонстрировал на двух типичных микро-
епоридиях с дву- и одноядерным строением споры. У возбудителя
пебрины при этом методе окраски двуядерная структура видна у большинства
спор, тогда как с этой же окраской, но без обработки соляной
кислотой, ее можно различить только у споронтсв и молодых спор.
Электронная микроскопия. Особое место в изучении возбудителя
пебрины и морфолого-цитологических особенностей строения стадий
его развития занимает электронно-мироскопическое исследование.
Необходимость в нем вызывается сочетанием весьма малых размеров
этого простейшего с многокомпонентностью его строения, особенно
споры, детали которого доступны наблюдению только при субмикро-
скопических средствах и методах исследования. Один микрометр
(таков средний размер спороплазмы — «планонта») — это точка в
световом микроскопе при увеличении в 600 раз; даже при самом скромном
увеличении электронного микроскопа (X10 000) она достигнет
одного сантиметра в поперечнике.
В отличие от световой оптики, которая для дифференциации микроскопической
картины, помимо оптических средств контрастирования,
широко использует различные методы окрашивания препаратов,
в электронной микроскопии основными средствами выявления структурных
особенностей исследуемого объекта являются методы оттене-
ния, негативного и позитивного контрастирования и методы реплик.
Кроме того, современные сканирующие микроскопы снабжены приспособлениями
для стереоскопического видения.
Вопросы для самопров ер ки
1. К ак о вы морфологические и структу рны е особенности спор во зб у д и т ел я пебрины?
2 . В чем р а з л и ч и я между планонтом Штемпеля и спороплазмой Исихары?
3. К а к о с ущ е с т в л я е т с я зар ажен и е пебриной и из к а к и х этаг.ов состоит этот
процесс?
4. Что т ак о е «вторично инфицирующая форма» и к а к и е вопросы решаются с
ее открытием?
5. К а к а я н а б лю д а е т с я последовательность з а р аж ен и я органов и тк ан ей тутового
шелкоп р яда ?
6. К а к происходит превращение спороплазмы в спору?
7. Как протекают тр ан со в ари ал ьн ая и герминативная передачи инфекции ноэе-
мы тутового ш елкопряда ?
8. К а к а я наблю да е тс я зависимость заражен н ости яиц в к л а д к е от зараженности
бабочек?
9. Каковы характерные п ри зн аки пебрины и особенности ее т еч ен и я?
10. К а ки е техн и ч е ски е средства и методы м и к р эскоп и р эвлн и я м о гу т быть использованы
д л я обнар уж ен и я спор пебрины?