5.2. Биология возбудителя пебрины

Систематическое положение ноземы шелкопряда. Возбудитель
пебрины тутового шелкопряда относится к типу простейших (Protozoa;
Goldfuss, 1820), классу книдоспоридий (Спidosporidia; Doflein,
1901), представители которых описаны как специализированные паразиты
различных членистоногих и некоторых других беспозвоночных;
к отряду микроспоридии (Microsporidia; Balbiani, 1882), к семейству
ноземсвидных (Nosematidae; Labbe, 1899), к роду нозема (Nosema;
Naegeli, 1875), к виду нозема тутового шелкопряда (N. bombycis
Naegeli; Stempell, 1909).
Первоначально род нозема относился к классу споровиков (Sporozoa;
Leiickart, 1879), к обширной группе простейших, образующих
в цикле своего развития стадию, заключенную в более или менее толстую
оболочку споры, приспособленную к сохранению во внешней
среде. Шаудин (1900) разделил эту группу простейших на два подкласса:
Telosporidia, включающего в себя грегарин, кокцидпй и некоторых
других, и Neosporldia, в число которых вошли, в частности,
микроспоридии. Однако Дофлейн (1901) предложил свою систематизацию
типа протозоа. Всех, кто имел
стрекательный аппарат (книдоцисты),
он выделил в подкласс, а затем— в самостоятельный
класс Criidosporidia, а
Telosporidia стали синонимом самостоятельного
класса под прежним названием
Sporozoa. Эти таксономические
преобразования в истории систематики
простейших послужили причиной тому,
что в литературе по шелководству возбудителя
пебрины дольше, чем следовало,
относили то к споровикам, то к
книдоспоридиям.
Цитоморфология споры. Возбудитель
пебрины во внешней среде сохраняется
в виде споры, являющейся стадией покоя
паразита. Под микроскопом споры
имеют вид эллиптических тел (рис. 85),
сильно преломляющих свет, блестящих,
с голубоватым оттенком. Величина

.

спор колеблется и составляет 3—4 мкм вдлину и 1,5—2 мкм в ширину.
Один из признаков семейства нозем — длина споры, которая не должна
превосходить ее ширину более чем в три раза. Размеры спор и форма
у разных нозем близки, если не подобны. Поданным Ватанабе(1975),
из 24 видов нозем, паразитирующих на разных видах чешуекрылых,
только три несколько отличались от остальных своими размерами.
Вариабельность размера спор не зависит от стадии развития насекомого.
На примере трех видов нозем, паразитирующих на репнице,
рисовой огневке и хлопковой карадрине, Ватанабе показал отсутствие
разницы в размере спор не только у этих видов насекомых, ной на всех
стадиях их развития — у гусениц, куколок, бабочек, а также у спор
из их трупов. Продольный разрез споры ноземы и топография ее органелл
показаны на рис. 86 и 87.
Оболочка споры, которая по своим физическим характеристикам
больше соответствует поня тию«скорлупка», бесцветная, с гладкой
поверхностью эластичная структура, о чем можно судить по способности
спор, деформированных под воздействием нагревания, восстанавливать
первоначальную форму. Толщина скорлупки 0,2—0,3 мкм,
на вершине переднего полюса она значительно тоньше. Оболочка
скорлупки обладает, видимо, физико-химическими особенностями,
позволяющими проникать в спору влаге окружающей среды и облегчающими
прободение полюса стрекательной нитью в процессе ее выбра-
сывапия. Известно, в частности, что полюсный участок скорлупки
легче набухает, он более пластичен и в отличие от остальной поверхности
скорлупки легче окрашивается специальными красителями.
Вещество скорлупки в своей основе — аминополисахарнд, близкий
или тождественный хитину, частично инкрустированный белками
и липидами. С внутренней стороны к своду переднего полюса скорлупки
плотно прилегает полюсный колпачок — куполообразное образование,
более толстое на вершине и постепенно утончающееся по направлению
к краям. Края полюсного колпачка простираются вдоль
внутренней стенки скорлупки на 1/6 ее протяженности.
Внутри споры находится спороплазма — протоплазматическое тело
простейшего, именуемое часто зародышем или амебоидом. Большую
часть спороплазмы занимают два ее ядра. Спороплазма окружена оболочкой—
плазматической мембраной и полирибосомами; ядра также
имеют двойную оболочку и окружены полирибосомами. По своему
местоположению спороплазма несколько смещена к переднему полюсу,
а позади нее, в пространстве у заднего полюса споры находится большая
вакуоль, ограниченная одиночной мембраной.
В передней части споры, вне тела споропласта расположена сферическая
вакуолеобразная структура —■ поляропласт. Образованный
в процессе дифференциации структурных компонентов споры, он,
по мнению некоторых авторов (Вейзер, 1966), является аналогом
остаточного тела у других простейших и представляет собой с копле-
ние неиспользованных в споруляции и обмене веществ неперев ар и вае-
мых продуктов. Поляропласт заполнен гелем с жидкой дисперсной
средой — пластическим содержимым, в котором под электронным микроскопом
обнаруживаются нерегулярные по форме нитевидные структуры
.
Стрекательный аппарат споры. Стрекательный аппарат книдо-
споридий служит отличительным признаком для всего класса; он
состоит из особого органа — книдоцпсты пли стрекательной капсулы.
Наименование это заимствовано протистологами из описания колющего
игловыталкивающего органа кишечнополостных, способных
выбрасывать его мгновенно, подобпо выстрелу с целью защиты или
нападения. У микроспоридий, и в том числе у ноземы, в споре находится
свернутая спиралью стрекательная нить. Передний ее конец
приближен к полюсному колпачку, несколько расширен, на краях
его — кольцевидное утолщение; отсюда синоним стрекательной нити —
полярная нить (см. рис. 87). Передняя часть стрекательной нити прямая,
проходит сквозь поляропласт, который выполняет главную функцию
в механизме выталкивания нити из споры. Затем она направляется
к боковым сторонам скорлупки споры, где переходит в спираль,
свернутую вдоль стенки споры в один ряд, образуя 10 витков и занимая
по периферии, в задней части, около 2/3 от общей длины споры.
Длина выброшенной полярной нити 90,7±Ммкм, толщина 0,2—
0,3 мкм (по Штемпелю, около 0,07 мкм).
Стенка нити представляет собой мембрану, окружающую канал,
пронизывающий нить по всей ее длине. Полая нить лежит в споре
в вывернутом наизнанку состоянии. На поперечных срезах через спору
спиральные витки имеют вид кружков с более темной сердцевиной,
образованной пучком фибрилл. При выбрасывании стрекательная нить
выворачивается на всем своем протяжении и ее внутренная поверхность
становится наружной, а фибриллы оказываются на поверхности,
вдоль всей длины нити, сообщая ей упругие свойства. Спираль нити
окружает внутреннее пространство споры, в котором расположены
спороплазма и задняя вакуоль.
Факторы, побуждающие к выбрасыванию стрекательной нити.
Осима (1937) вел наблюдения, помещая споры в каплю кишечного
сока гусениц. Нить выбрасывалась так стремительно, что наблюдать
в микроскоп за деталями этого процесса было невозможно. Он использовал
с этой целью также перекись водорода, а чтобы замедлить скорость
выбрасывания нити, прибавлял к перекиси гипертонический
раствор поваренной соли (5—10%). С увеличением концентрации соли
спираль нити раскручивалась медленнее, а процент спор, выбрасывавших
нить, уменьшался. В 10%-ном растворе выбрасывание нити наблюдалось
только у половины спор, а в 25%-ном растворе споры нить
не выбрасывали. Достаточно было разбавить этот раствор, как выбрасывание
нити возобновлялось даже после трехчасового пребывания
спор в 25%-ном растворе соли. В дальнейшем испытывали другие
средства, чтобы принудить споры привести в действие стрекательный
аппарат; само явление это приобрело интерес как экспресс-метод для
косвенного установления жизнеспособности спор пебрины, в частности,
при испытаниях эффективности дезинфицирующих средств. Ватанабе
(1975), например, перечислил четыре метода провокационного воздействия
на споры:
1) регидратация (увлажнение) подсушенных на воздухе спор;
2) перенос спор и нейт ральную среду после их щелочной обработки;
3) обработка спор 1,5—3%-ной перекисью водорода;
4) суспензнрование спор в щелочном буфере (pH 10,1), содержащем
ионы калия.
Изучалось также влияние сочетания температуры и химических
раздражителей на выбрасывание стрекательной нити (1979).
Электронномикроскопическая картина выхода спороплазмы. Первоначальное,
во времена световой микроскопии представление о процессе
выбрасывания стрекательной нити и выходе спороплазмы складывалось
из наблюдений и домыслов. Так, Дисенайк и Кенинг (1957),
изучая микроспоридию саранчовых, полагали, что стрекательная
нить не имеет канала, что она сплошная и что амебонднын зародыш
прикреплен к ее свободному концу; выброшенная нить, как пружина,
выталкивает амебоид из споры, который затем отделяется от ее конца.
По представлению других авторов, зародыш отделяется от оболочки
споры и выползает через отверстие, образованное после отрыва стрекательной
нити, становясь подвижной стадией паразита.
Между тем строение стрекательного аппарата, как его изобразил
Штемпель, исключает возможность выхода зародыша, так как выход
закрыт полярной капсулой. Узкая часть полярной капсулы — еа
горлышко — изображено им как внутренняя стенка канала полюсного
отверстия споры, а передний конец стрекательной нити помеща-

ется внутри горлышка капсулы
и примыкает к внешнему краю
выходного отверстия споры. При
таком строении стрекательного
аппарата выбрасывание нити,
начиная с заднего свободного
конца спирали, могло произойти
только при условии прикрепления
ее сбоку выходного
отверстия. Кроме того, полярная
капсула служила бы препятствием,
если амебоид, лежащий,
по Штемпелю, кольцом
вокруг наружной стороны капсулы,
должен был войти в полюсное отверстие сюры. Настаивая на
наличии полярной капсулы, оставалось только допустить, что перед
выходом зародыша она предварительно растворяется.
Более верные представления относительно устройства и функционирования
стрекательного аппарата у ноземы возникло под влиянием
наблюдений за этим процессом в световой микроскоп еще у Морген-
талера (1927) на примере пчелиной ноземы и у Осимы (1937) при наблюдении
за выбрасыванием нити из споры возбудителя пебрины и за
выходом из нее амебоида.
Осима показал в нативных препаратах, в которых было спровоцировано
выбрасывание стрекательной нити, и на микрофотографиях,
что эта нить может быть только трубкой. По ее каналу проходит
зародыш споры и появляется на ее свободном конце в виде сферического
тела, 3—6 мкм в диаметре (рис. 88). Незначительная ширина
канала стрекательной нити не является препятствием для перемещения
по нему зародыша; известно, что лейкоциты выходят в окружающие
ткани через межмолекулярные пространства неповрежденной
стенки капиллярных сосудов (диапедез). Сферическое тело появляется
на конце нити только после ее полного выбрасывания (см.рис.88). При
этом выход его после выбрасывания нити происходит неодновременно
и у части спор запаздывает. Блеск споры и самой стрекательной нити
после выхода зародыша уменьшается, так как если бы он зависел от
ее содержимого, а не от отражающей способности скорлупки споры;
если выбрасывание нити замедлено и спора не освобождается от своего
содержимого, блеск ее сохраняется. Спустя некоторое время сферическое
тело отделяется от конца нити, окруженного оживленно двигающимися
зернышками, а сама нить отрывается от опустевшей
оболочки споры и переваривается кишечным соком гусеницы.
Много позже Крамер (19G0) проследил на окрашенных препаратах
отдельные этапы выхода амебоида из спор ноземы, поражающей личинок
мучного хрущака, а Лом и Вавра (1931) прозели микрокиносъемку
этого процесса у микроспоридии, близкой в систематическом отношении
к возбудителю пебрины. Однако внутреннее строение споры и его
участие в выбрасывании стрекательной нити, а также детали прохождения
по ней спороплазмы остались недоступными для разрешающей
способности световой оптики. На помощь пришла электронная микроскопия.
Наиболее полное использование электронного микроскопа
при изучении возбудителя пебрины осуществлено Исихарой и Хаяши
(1968). Они ознакомились с цитологией спороплазмы до и после выхода
из споры, в свободном состоянии во внешней среде и внутри инфицированной
клетки. Выбрасывание полярной нити провоцировали
щелочью и тут же споры помещали в подогретую гемолимфу гусениц.
Чтобы наблюдать спороплазму не только в споре, где цитологические
детали плохо различимы, исследовали препараты из ультраточких
срезов клеток шелкоотделительной железы, суспензированных в подогретой
гемолимфе вместе со спорами. В течение разного промежутка
времени с момента заражения клеточной суспензии спорами — от
7 мин, до 1 ч — клетки железы и споры фиксировали, ультрамикро-
томировали и из сверхтонких срезов изготавливали препараты; на
препаратах были видны споры, которые готовились вытолкнуть стрекательную
нить и спороплазму, спороплазму, вышедшую в гемолимфу,
и спороплазму, инфицировавшую клетки железы.
Под воздействием щелочи (по аналогии с тем, что испытывает
спора в пищеварительном соке средней кишки гусеницы) верхушечный
участок переднего полюса скорлупки споры становится проницаемым
для жидкости, поляропласт начинает набухать, размеры его увеличиваются;
при этом он давит на содержимое споры и гидростатическим
усилием смещаются спирали и свободный конец стрекательной нити,
она начинает выворачиваться на лицевую сторону. Продолжая раскручиваться,
стрекательная нить выталкивается через образовавшееся
отверстие на переднем полюсе скорлупки. По мере выбрасывания нити
поляропласт перемещается в заднюю часть споры под спороплазму
я вталкивает последнюю в канал нити. С продвижением спороплазмы
к дистальному, свободному концу нити с отверстием, эластичная стенка
канала растягивается. По этим каплевидным, электронно солее
плотным расширениям, представляется возможным проследить за
процессом выхода спороплазмы из споры.
До конца выбрасывания стрекательной нити полюсный колпачок плотно прилегает к скорлупке споры и удерживается ею. По мере выхода спороплазмы эластичные края полюсного колпачка начинают втягиваться внутрь споры, отделяясь от скорлупки. Когда большая часть спороплазмы оказывается вытолкнутой из споры, становится видимой тонкая мембрана, соединенная с краями полюсною колпачка и образующая вместе с ним мешок. По мере выхода нити и спороплазмы участки с высокой электронной плотностью постепенно смещаются к переднему полюсу споры, а задняя часть споры, вакуоль и середина становятся более прозрач

ными (рис. 89). С момента внесения спор в суспензию клеток шелкоотделительной
железы начало инвазирования их спороплазмой
можно было наблюдать примерно по истечении семи минут.
Биологическая функция стрекательной нити. В свое время Осима
(1937) наблюдал, как вышедшее из споры и появляющееся на конце
стрекательной нити сферическое тело приклеивалось к покровному
стеклу, вследствие чего конвекционный ток не мог увлечь плавающую
спору из поля зрения. Участки нити, содержащие клейкую жидкость,
тоже легко прилипали к покровному стеклу, так как эта жидкость
была способна, видимо, проходить через мембрану стрекательной нити.
Являлась ли жидкость спутником выходящего из споры амебоида или
последний сам обнаруживал способность прилипать к покровному
стеклу, оставалось не выясненным. Было высказано предположение,
что с помощью этих клейких свойств спора прикрепляется к стенкам
средней кишки и что главная функция стрекательной нити — фиксация
споры в средней кишке с тем, чтобы до выхода подвижной стадии
паразита она не была выброшена из кишечника с экскрементами.
В другом варианте высказываний относительно биологической
функции стрекательной нити, ее роли в инвазионном процессе приводились
соображения о возможности токсического действия вещества,
выделяемого нитью, на клетки эпителия кишечника гусеницы, которое
облегчает процесс внедрения в них паразита (Осима, 1947; Кудо,
1924). В подтверждение этой версии ссылались на аналогичную роль
стрекательной нити некоторых паразитических животных. Наличие
токсикоза пытались усмотреть также в том, что скармливание гусеницам
большого количества спор возбудителя пебрины вызывает быстрое
возникновение бактериальной септицемии при участии отдельных
представителей пассантнои бактериальной флоры. Смерть наступает
значительно раньше, чем возбудитель пебрины успеет оккупировать
ткани гусеницы. Ей предшествует обильное проникновение бактериальной
флоры кишечника в кровь, что, по мнению этих авторов, говорит
о нарушении защитной функции эпителия средней кишки. Однако
такое явление может быть не только следствием отравления эпителиальных
клеток и утратой ими обычной сопротивляемости бактериальной
инфекции, но и результатом механического повреждения клеточного
барьера множественной инвазией ноземы.
Предполагалось, что стрекательная нить микроспоридий выполняет
роль не только фиксатора споры в кишечнике насекомого, но
и специализированного органа для введения спороплазмы непосредственно
в заражаемую клетку.
Об этом свидетельствуют электронограммы Исихары (1968), снявшего
клетки шелкоотделительной железы, суспензированные в гемолимфе
и зараженные спорами возбудителя пебрины. Выброшенная
из споры стрекательная нить, преодолевая сопротивление оболочки
инвазируемой клетки, концом прокалывает ее и внедряется в периферическую
зону цитоплазмы. Эти наблюдения сделаны не на эпителии
средней кишки, куда попадают споры ноземы при естественной инфекции,
а на клетках органа из целомической полости гусеницы; по-видимому,
происхождение поражаемой клетки несущественно для дееспособности
стрекательного аппарата.
Еще Осима (1937) показал, что не только стрекательная нить, но
и спороплазма, попавшая в кишечник гусеницы, под действием пищеварительного
сока через некоторое время разрушается. В кишечнике
от губительного действия пищеварительного сока спороплазму надежно
защищает скорлупка споры. Кроме того, опасную зону с кишечным
соком спороплазме помогает благополучно миновать стрекательный
аппарат споры. Эта функцнн стрекательной нити необходима облигатному
паразиту в противовес формированию у насекомых в ходе
эволюции противоинфекционной защиты со стороны пищеварительного
сока средней кишки. Вейзер (1966) полаг ал, что если спороплазма
ноземы не всегда может быть непосредственно введена в клетку, содействие
инвазии со стороны стрекательной нити выражается «хотя бы
в том, что она доставляет спороплазму непосредственно к стенке кишечника
». Как при этом преодолевается находящаяся на ее пути пери-
трофическая мембрана, удалось увидеть много позже (Абе, 1978).
Почему спороплазма, а не планонт? Двуядерное тело спороплазмы
в старых работах называли зародышем или амёбоидом. Штемпель
предложил свой термин — планонт (греч.— бродя га) для промежуточной
стадии между зародышем, вышедшим из споры, и стадией внутриклеточного
паразитизма — меронтом. По Штемпелю, стадия планонта
образуется после слияния двух ядер у вышедшего из споры амебоида.
Планонт имеет округлую или слегка эллипическую форму (диаметр
0,5—1,5 мкм) и напоминает по размерам шаровидную бактерию кокк.
В центре расположено ядро, которое в нативном препарате можно
различить в виде блестящей точки. Планонт передвигается амебоидными
движениями и имеет тонкую протоплазматическую оболочку, позволяющую
передвигаться с помощью псевдоподий. Часть планонтов
проникает в эпителиальные клетки кишечника, другие проползают
по межклеточным пространствам в гемолимфу. Током крови планонты
разносятся в общей полости и внедряются в ткани омываемых ею органов.
По Штемпелю, планонты размножаются в кишечном канале
и в гемоцеле зараженного насекомого до их превращения в стадию
внутриклеточного паразита. Однако Омори (1912) и Кудо (1916) не
удалось обнаружить «планонта». Исихара (1969), ссылаясь на работы
ряда авторов, отмечает, что первым этапом заражения насекомого
является непосредственное проникновение спороплазмы из споры
в клетку по каналу стрекательной нити, а блуждающая и размножающаяся
вне клетки стадия «планонта», по его мнению, является плодом
воображения исследователя.
В дальнейшем было показано (см. гл. 5, раздел «Вторично инфицирующая
форма ноземы»), что совмещение планонтом способности
к размножению, расселению в насекомом и инфицированию клеток
без участия стрекательного аппарата присуще также спороплазме
но проявляется это раздельно, на разных этапах ее последующего
развития в ходе инфекционного процесса.
Цитологическое описание спороплазмы иоземы тутового шелкопряда.
Исихара (1968) исследовал цикл развития ноземы шелкопряда
вне организма, заражая клетки переднего отдела шелкоотделительной
железы, суспензированные вместе со спорами
в подогретой гемолимфе. Чтобы вызвать выбрасывание полярной
нити в этих условиях, он предварительно обрабатывал
споры слабым растеором щелочи. Затем под электронным
микроскопом и на ультратонкнх срезах он изучал
процесс заражения клетки и детали строения спороплазмы.
Структурные детали

спороплазмы (рис. 90), не попавшей в клетку и пыброшеной стрекательной нитью в гемолимфу, были более доступны для изучения.
Она окружена гладкой одиночной плазменной оболочкой (пелликулой)
и содержит два ядра, каждое из которых имеет двойную мембряну; они тесно сближены и разделены очень узким шелевидным пространством. Наружная поверхность спороплазмы покрыта тонким слоем материала, чернеющего от осмиевой кислоты, под которым находится структурный слой, состоящий из плотно уложенных в наклонном положении коротких трубок диаметром в 50 нм, образующих шероховатую поверхность. Цитоплазма содержит многочисленные рибосомоподобные частицы; в ней рассеяны или прикреплены к внутренней поверхности
плазменной оболочки многочисленные электронно-плотные сферические зерна, которые, так же как эндоплазматическая сеть, окружающая ядро, содержат РНК. и являются центром синтеза белка. Клеточные ядра состоят из однородного гранулярного материала.
В ядре есть электронно-плотный участок; возможно, что этонуклеола
(ядрышко), представляющая собой сеть анастомозирующих нитей
ядерных рибосом с высоким обычно содержанием РНК. Эндоплазматч-
ческая сеть встречается редко и имеет незернистую (агранулярную)
структуру, типичных митохондрий в спороплазме он не встречал.
Размножения спороплазм вне клеток не наблюдалось; выброшенная
спорой в подогретую гемолимфу спороплазма вскоре претерпевала деструктивные
изменения, сжималась, сохраняя оба ялра с небольшим
количеством окружающей их цитоплазмы, или же напротив — набухала,
в ядрах появлялось множество нитевидных образований.
В спороплазме, инъецированной стрекательной нитью в клетку и:елкоотделительной
железы, были обнаружены те же структуры, что и в
выброшенной непосредственно в гемолимфу. Спороплазма, оказавшаяся
внутри клетки, окружена двойной мембраной; из них внутренняя,
сходная с андоплазматической сетью с гладкой поверхностью,
расположена вдоль внутренней поверхности наружной цитоплазматической
мембраны; иногда было видно, что подобная мембрана окружает
и ядра. Рмбосомоподобпых частиц в пораженной клетке больше, чем в

спороплазме, вокруг которой они сосредоточены на наружной поверх-
пости, как бы образуя вокруг нее дополнительный структурный
слой. Это ответная реакция клетки в начальный период ее заражения
на присутствие ноземы.
Внутриклеточная стадия паразита. По Штемпелю, планонт, проникший
в клетку, спустя некоторое время превращается в меронта.
Он имеет неправильную округлую форму, вытянутую в виде эллипса,
более плотную (чем у планонта) пелликулу, четко обрисовавшую его
контур и лишающую его возможности передвижения с помощью
псевдоподий. Ядро меронта окружено кольцеобразным светлым пространством.
Размеры молодых меронтоэ не превышают 2 мкм. взрослые
перед делением вырастают д о 5 мкм, у крупных особей эллиптической
формы большой диаметр достигает 9 мкм.
Исихара изучал внутриклеточную стадию развития ноземы тутового
шелкопряда в культуре клеток яичника, которую он заражал
спорами. Наблюдения велись с помощью светового микроскопа ( хПОО)
в препаратах окрашенных по Гимзе (рис. 91). Спороплазма тотчас же
после выхода из споры имела два ядра, они были округлыми, компактными,
ярко-красною цвета; окружающая же их цитоплазма
столь слабо воспринимала окраску, что обнаружить присутствие спороплазмы
в препарате можно было только по интенсивно окрашенным
ядрам. Первые часы после заражения нозема, паразитируя внутри-
клеточно и питаясь, увеличивается в размерах, сохраняя исходную
округлую форму. Она развивается в крупный бннуклеарный плазмодий
(ьшизонт»), который в отличие от спороплазмы имеет отчетливо
красящуюся по Гимзе цитоплазму в голубой цвет и тесно сближенные
красные ядра. По мере роста плазмодия ядра становятся менее компактными,
более рыхлыми, светлоокрашенными и менее правильными
по очертанию.
Бесполое размножение ноземы. После проникновения спороплазмы
в клетку, спустя некоторое время она достигает определенных раз-
меров и приступает к серии делений, представляющих собой бес пол се,
агамное размножение, которое происходит без участия специализированных
половых клеток — гамет. У протозоа агамное размножение
может происходить путем митотического (кариокпиетпческого) непрямого
деления родительской особи с образованием дочерних. Оно может
быть монотомическим, с однократным бинарным делением ('надвое)
или множественным — шизогонией. Шизогония — очень частое явление
среди простейших класса споровиков и книдоспоридий. Взрослые
формы, подвергающиеся шизогония, принято называть шизонтами,
а молодые, представляющие продукт шизогонии — мерозоиптми (и-и-
зоэоитами — у французских авторов)- У микроспоридии особи бесполого
размножения, делящиеся монотомически бинарно (однократное
деление на две дочерние клетки) некоторые авторы называют
меронпмми.
Штемпель различал у стадии внутриклеточного паразитирования
несколько способов бесполого размножения: простым делением ма две
клетки, почкованием и множественным делением. Меронт вначале
делится монотомически бинарно, затем дочернее поколение меронтов
превращается в шизотов и делится множественно. При шизогонии
процесс деления ядра проходит значительно скорее, чем цитоплазмы:
ядро в одноядерном шизонте делится на два, каждый из которых делится
снова и образуется четыре одноядерные дочерние клетки. Штемпель
описал также деление меронтов со значительной задержкой деления
цитоплазмы, в результате чего образуются длинные, похожие
на четки, многпядерные клетки.
Ватанабе (1974) изучал цикл развития и биологию ноземы египетской
хлопкоеой карадрины в мазках из средней кишки зараженных
им гусениц, окрашенных по Гнмзе. Нозема эта оказалась довольно
близкой по своему таксономическому положению к возбудителю пебрины
тутового шелкопряда и, так же как нозема шелкопряда, заражает
гусениц многих видов, за исключением самого тутового шелкопряда.
Ватанабе отметил, что спороплазма развивается в клетках средней
кишки в большой двуядерный шнзонт с умеренно красящейся поГичзе
цитоплазмой в голубой цвет с ярко-красными ядрами. На третий
и четвертый день после заражения дзуядерные шизонты становятся
преобладающей формой паразита с размерами 3,2 х 3,4 мкм. Четырехъядерные
(тетрануклеарные) шизонты встречаются реже, они крупнее
двуядерных — 4,6 х 3,9 мкм; восьмиядерные встречаются крайне
редко. На пятый-шестой день после заражения наблюдаются дву-
ядерные, четырехъядерные, делящиеся четырехъядерные шизонты, а
также споробласты, споронты и молодые споры. Деление ноземы в препаратах
отмечается нечасто и это, как полагает Ватанабе, указывает
на то, что происходит оно очень быстро и потому трудно уловимо.
По мнению Исихары, размножение ноземы тутового шелкопряда
в клетках начинается после того, как паразит примет овальновьпяну-
тую форму, но не ранее, чем через час после инвазии, и происходит
монотомически бинарно. До достижения этой удлиненной формы,
которая хорошо различима в световом микроскопе в окрашенных препаратах,
плазмодий ноземы в обильно зараженных клетках обнаружить
очень трудно, даже с помощью фазово-контрастного устройства.
Шизогония, по мнению Исихары, представляет собой редкое явление,
«если она вообще возможна у ноземы». Возникновение четырехъядерных
форм или коротких цепочек из двуядерных форм он рассматривает
как результат бинарного деления ядер, опережающее в этом цитоплазму.
Бннуклеарный тип строения ноземы шелкопряда. В последние годы
становится общепринятым представление о бинуклеарном (дипло-
кариотическом) строении ноземы шелкопряда, которое можно проследить
в течение всего периода ее жизни, от вышедшей из споры
спороплазмы до стадии споры. Согласно Исихаре (I9G8, 1970) и Кали
(1970), ядра у нозем всегда имеют парное расположение. Спраге и Верник
(1971) считают эту особенность существенным систематическим
признаком рода нозем. Иногда ядра двуядерных особей расположены
столь тесно, что разграничивающая их тонкая щель невидима и плазмодий
ноземы кажется одноядерным.
У стадии внутриклеточного развития бинуклеарная форма наиболее
частая, но встречаются и тетрануклеарные (четырехъядерные
шизонты) (рис. 91, 3—4)\ ядра у них тесно сближены попарно и каждое
из них покрыто оболочкой, которая под электронным микроскопом
кажется несколько более плотной по линии их соприкосновения. Че-
тырехъядерные плазмодии делятся не на одноядерные, а надвуядерные;
перед делением ядра у тетрануклеарных плазмодии мигрируют парами
к полюсам клетки и остаются спаренными на всех этапах их деления.
Иначе говоря, они ведут себя как так называемые полизнергид-
иые (многоядерные) клеточные образования.
Исихара избегает употребления термина шизонт применительно
к внутриклеточным формам ноземы во время ее агамного размножения,
как это все еще встречается у многих его современников (Ватанабе,
Вейзер). Такая осторожность с его стороны объясняется, по-видимому,
сомнением относительно правомочности считать множественным
делением — шизогонией случаи, когда четырехъядерная клетка
(«тетрануклеарный шизонт») делится мономерно на две бинуклеарные
дочерние особи. В свете этих сомнений нам представляется более
приемлемым назвать стадию внутриклеточного агамного рамножения
ноземы плазмодием, по аналогии с плазмодиями малярии — возбудителями
заболеваний крови человека из класса споровиков, поскольку
это наименование в данном случае не затрагивает особенностей
размножения и не уточняет его положения в жизненном цикле.
Споронты. Изучая жизненный цикл ноземы тутового шелкопряда
в культуре клеток яичника, Исихара установил, что спорогония (спо-
руляция или спорообразование) обнаруживается со второго по четвертый
день после заражения. Заключительный этап стадии агамного
размножения перед началом споруляции ознаменовывается появлением
двуядерных споронтов (буквально — «превращающихся в спору»)
в результате деления тетрануклеарных плазмодиев ноземы.
Начало споруляции сопровождается специфическими изменениями
б геле плазмодия, который становится более вытянутым (6,2 х 2,7 мкм
и менее), равномерно скрашивается по Гимзе. Цптоплазма на полюсах
становится темной, иногда с субполярными поперечными полосами,
центральная же зона остается бледной. Под электронным микроскопом
споронт отличается от стадии агамного размножения плазмодия ноземы
(шизонта) хорошо различимым поверхностным слоем, образованным
радиально расположенной трубчатой структурой. Поверхностный
слой плазменной мембраны окрашивается осмием; вначале он составлен
из отложений глыбок неправильных по форме, прикрывающих детали
строения трубчатого слоя; затем этот слой на поверхности мембраны
становится толще, цитоплазма и клеточное ядро — болез плотными,
отчетливо видны ндернаи мембрана и эндоплазматическая сеть. Позже
по мере формирования наружного слоя оболочки споры трубчатая
структура становится неразличимой. На пятый-шестой день после
заражения культуры клеток шелкоотделительной железы в них присутствовали
делящиеся тетрануклеарные особи, бинуклеарные споронты,
споробласты и молодые споры.
Споробласты. Митозы у споронта начинаются с образования четырех
ядер, которые попарно мигрируют к полюсам, затем все тело
споронта делится бинарно, образуя два дочерних бинуклеарных споро-
бласта. Спраге и Верник (1971) характеризовали ноземукак образующую
споронта, который делится на два споробласта, чем отличается от
других близких ноземам микроспоридии, а также тем, что в отличие
от этих микроспоридий споробласт ноземы всегда бинуклеарен.
Исследуя цикл жизни возбудителя пебрины, Исихара утверждал,
что .хотя споронт иногда делится на два споробласта, тетрануклеарные
споронты, подготовленные к такому делению, встречаются очень
редко. Ватанабе, изучая в мазках нозему из египетской хлопковой
карадрины, установил наличие тетрануклеарных споронтов и деление
их на дра бинуклеарных споробласта, хотя такое диспоробластическое
развитие ноземы (на два споробласта) обнаруживается, по его мнению,
редко. Большинство споронтов бинуклеарны и, как он полагает, развиваются
непосредственно в бинуклеарных споробластах. Складывается
представление, что нозема не только полиэнергидное простейшее
с двуядерным аппаратом, но и моноспоровый род, развитие вегетативных
особей которого завершается образованием одной двуядериой
споры без деления простейшего на стадии, предшествующие спорообразованию.
Размеры молодых споробластов 3,9 х 2,3 мкм, форма их более
или менее четко контурированная яйцевидная, в более узком копие
лежат два сравнительно слабо окрашенных и сомкнутых вместе яДря.
В цитоплазме видны полярно расположенные гранулы, иногда со слабо-
окрашенной прядью нитей, простирающихся от гранул к ядрам.
Иногда через цитоплазму проходят окрашенные по Гимзе темнопурпуровые
пересекающиеся линии. Взрослый споробласт становится
более компактным с более резко обозначенными линиями, обрисовывающими
его строение. Под электронным микроскопом у молодого
споробласта поверхностный слой оказывается толще, чем у предшествующей
стадии, достигая 50—СО нм. Непосредственно под плотным
поверхностным слоем, над поверхностью исходной плазменной мембраны,
образуется электронно-прозрачный слой. Толщина всей этойфор-
мирующейся оболочки достигает 200 нм, а толщина полностью развитой
скорлупки споры около 250 нм, за исключением вершины переднего
полюса, где она составляет примерно 80 нм. Вместе с тем трубчатый
слой в толще наружной оболочки споронта сохраняется у споробласта,
несколько выступая над поверхностью; предполагают, что
такая структура оболочки обеспечивает возможность интенсивного
поступления питательных веществ, необходимых для формирования
внутренней структуры и завершения спорообразовательного процесса.
В ядрах споробласта вначале формируются электронно-плотные
глыбки хроматина, но по мере созревания споры содержимое ее ядер
становится гомогенным. Цитоплазма споробласта по сравнению с предшествующими
стадиями становится значительно более плотной. Просветы
в цитоплазме между эндоплазматической сетью обильно заполняются
рибосомами. В молодых споробластах различают также кольцевидные
мембраны, похожие на аппарат Гольджи.
Формирование споры. Первые признаки формирования комплекса
поляропласта и стрекательной нити споры видны в электронном микроскопе
уже в молодых споробластах. На переднем конце некоторых
из них можно различить плотно уложенные в виде полос зачатки
трубок и пластинок будущего поляропласта споры. Поляропласт образуется
из пакета этих тонких пластин, напоминающих некоторые
детали строения аппарата Гольджи. Из этих исходных структур формируется
также полярный мешок.
В ультрамикротомированных споробластах более позднего периода
можно различить поперечные срезы через формирующуюся стрекательную
нить в виде неправильных асимметричных кругов, каждый
из которых содержит более плотную центральную сердцевину. Они
расположены вдоль обеих сторон по периферии споробласта. Стенка
стрекательной нити состоит из относительно плотного, аморфного слоя
н, предположительно, образуется при участии плотного, гранулированного
материала цитоплазмы споробласта путем его агрегации.
По другим предположениям наружный слой стрекательной нити образует
внешний слой двойной мембраны аппарата Гольджи. Задняя вакуоль
у многих споробластов не видна.
Цитоплазма и ядра молодых спор окрашиваются легче, чем у старых
спор, которые обычными методами окраски по Гимзе не окрашиваются
без предварительного протравливания, например, по методу
Вейзера. Пол электронным микроскопом видно, что гомогенное, умеренно
плотное клеточное ядро окружено ядерной оболочкой и слоем
цитоплазмы, содержащей полисому (или полирибосомы — рибосомы,
объединенные в комплекс с помощью молекулы информационной РНК,
образующиеся во время синтеза белковых макромолекул), расположенную
зигзагообразно. Вся эта часть споры заключена во вместилище
(.цистерну*) из эндоплазматической сети, так что ядра кажутся заключенными
в мешок, отделяющий их от остальной цитоплазмы споры
и поляропласта. Это расположение ядер в споре непосредственно граничит
с поляропластом.
Споры имеют тенденцию образовываться, начиная с периферии пораженной
клетки, с ее отдаленной от активного клеточного центра
зоны. Эти наблюдения наводят на мысль, что нозема в оккупируемой
ею клетке встречается с условиями, если не отчетливо антагонистическими,
то все же, в известной мере, тормозящими спорогонию.
Гаметогенез и автогамия. В жизненном цикле простейших чередуются
два типа поколений: агамное (бесполое) и половое. Особи бесполого
поколения растут и размножаются в условиях, чаще всего, паразитарного
образа жизни и дают начало половому поколению в форме
специализированных мужских и женских половых клеток — гамет.
У многоклеточных организмов образование гамет (гаметогенез) происходит
в результате двуступенчатого мейотического «деления созревания
», состоящего из редукционного и эквационного делений. Во время
редукционного или собственно мейотического деления сначала
происходит слияние (конъюгация, синапсис) гомологических хромосом
и взаимный обмен генами, затем во время деления в каждую клетку
переходят спаренные гомологичные хромосомы, и количество их
в двух образовавшихся дочерних клетках окажется сокращенным
вдвое — редуцированным, гаплоидным. Эквационное (гомеотичное)
деление происходит без уменьшения числа хромосом. Это обычный
митоз (кариокинез) с расщеплением каждой хромосомы ка две тождественные
половины, отчего количество гаплоидных особей, образовавшееся
в итоге мейоза, сохраняется.
У ряда систематических групп протозоа половое поколение образуется
мужским и женским началом в виде двух гаплоидных ядер,
принадлежащих одной клетке, которая носит название атогаметоиипг.
Слияние этих ядер в одной и той же клетке и образование диплоидного
знготического ядра представляет собой особую форму полового
акта, названного самооплодотноренигм или автогамией. Принято
считать, что случай наиболее бесспорной автогамии в мире простейших
описан именно у микроспоридии. Эти представления в значительной
мере обязаны своим возникновением классическому описанию
Штемпелем цикла развития ноземы шелкопряда. По Штемпс-лю, этот
цикл начинается со смены бесполого агамного размножения спорообразованием,
после которого происходит автогамия. У одноядерного споробласта
в ходе спорообразования от ядра отделяется одно небольшое
дочернее ядрышко, которое делится на два; эти ядрышки участвуют
в образовании скорлупки споры. Затем от материнского ядра отделяется
еще одно ядро, которое участвует в образовании полюсной капсулы
и стрекательной нити.В зрелой споре имеется два ядра, происходящих
от одного, которое разделилось после начала развития покоящейся
споры в кишечнике гусеницы. Двуядерный зародыш отделяется
от оболочки споры и, выйдя из нее, становится подвижной стадией
— амебоидом, с амебоподобным псевдоподиальным способом передвижения.
Спустя некоторое время оба ядра амебоида сливаются,
и он становится следующей стадией ноземы — планонтом. Тем самым
зародышу по существу происходящего приписывается функция авто-
гаметоцита. Планонт инвазирует клетку и превращается во внутриклеточную
стадию паразитизма — новое поколение агамного размножения.
Можно ли в описанном Штемпелем процессе ф р а к ц и о н и р
о в а н и я ядерного аппарата споры видеть возникновение гаплоидной
ядерной фазы из диплоидной или же это происходит позже, при
делении ядра в споре с началом ее развития в кишечнике гусеницы
после состояния покоя? К сожалению, достаточных оснований для точного
ответа на этот вопрос нет; сведения в монографии Штемпеля позволяют
выбрать произвольное суждение.
Место полового процесса в цикле развития ноземы. Протистологи
нашли, что у части изучаемых ими одноклеточных организмов распространена
одноступенчатая смена ядерных фаз в гаметогенезе,
который сводится только к одному редукционному делению. Одноступенчатый
мейоз достоверно известен у класса споровиков с зиготиче-
ской редукцией, при которой мейсз происходит при первом делении
"зиготы. Это единственная диплоидная фаза в их жизненном цикле.
Что же касается микроспоридий, то у них прогамный период (предшествующий
образованию гамет) также «сильно редуцирован», а типичный
половой процесс в их цикле «не обнаружен, если не считать
слияния ядер планонта атипичной копуляцией» (Догель и др., 19G2).
Эти критические сомнения в адрес утверждений Штемпеля могут быть
усилены, если вспомнить, что половой акт у простейших обычно рассматривается
как предшественник споруляции, способный стимулировать
наступлеме последней (Sprague, Vernick, 1968).
Более приемлемо описание цикла развития микроспоридий, данное
Вейзером (!966). На примере микроспоридий из рода 'Ihelohania он
привел следующую схему жизненного цикла. Двуядерный зародыш
сразу после выхода из споры делится, и дочернее поколение представляет
собой амебоидов (планонтов) с одним ядром, которые «проникают
в кишечный эпителий и по мере продвижения преобразуются вшизон-
товь. Многоядерные шизонты, размножаясь, делятся на мерозоитов
(они же — мероиты); у них пузыревидное ядро, с кариосомой в центре
(хромагиноваи масса глыбок, не содержащих РНК) и слабоокрашен-
ная цитоплазма. После «возникновения лентовидной стадии развития»
(плазмодия со многими ядрами) она делится и возникает следующая
стадия развития с двумя близколежащпми ядрами. Эти ядра увеличиваются
в несколько рази становятся похожими «на кофейные зерна,
которые тесно сближены своими вогнутыми сторонами». По предположению
Вейзера, эта «диплокариотическая», двойная форма, как ее
назвал Дебезье (1919), является автогаметоцитом, у которого водной
клетке помещаются мужское и женское ядра. Судя по этому предположению
Вейзера, «диплокарионт» — если он автогаметонит, является
продуктом мейотического деления. Далее имеет место автогамия,
которая совмещается с циклом «бурных митозов». В результате появляются
два дочерних ядра, и клетка делится ка два споронта.
Схема Вейзера упускает из виду, что у части микроспоридий —
как это показано на примере возбудителя пебрины — особи постоянно
сохраняют бинуклеарную структуру, начиная с «планонта» (спороплазмы)
и кончая спорой. Правда, Вейзер отмечает, что «у некоторых
родов микроспоридий (октоспора, баииллидиум^ оба ядра и после
перехода в покоящуюся стадию остаются постоянно друг возле друга
и делятся всегда одновременно; таким образом, в стадии спорогонии
микроорганизм всегда двуядерный». Однако в этой ремарке нельзя
усмотреть ссылку на существование, по крайней мере, части микроспоридий
с дикариотической структурой постоянного, а не этапного
характера. Неопределенность и противоречивость представлений,
касающихся смены ядерных фаз и особенностей полового процесса
у ноземы тутового шелкопряда, в значительной мере вызваны ее малыми
размерами. Кроме того, известной помехой для анализа смены ядерных
фаз является дикариотическая структура этого простейшего.
Нет сомнения, однако, что дальнейшее совершенствование методики
и техники электронной микроскопии позволит преодолеть эти затруднения.