3.4. Цитоплазматический полиэдроз

Открытие нового вируса. Болезнь , к оторая вызывает фляшерие-
подобную гибель выкормок тутового шелкопряда, н а зв ан а цитоплазматическим
полиэдрозом, открыта в 1934 г. японским ученым
Ишиыори. Первое время это заболевание не считалось заслуживающим
вн им ан и я , пока не было установлено, что оно широко распространено
в Японии (Оба с соавторами, 1955; Куриму, 1955).
Вирус пораж ае т клетки эпителия средней кишки гусеницы, где
о б р а зу е т полиэдры (рис. 63). От вируса ядерного полиэдроза он отли
чается содержанием Р Н К , а не Д Н К , сферической, а не палочко-

видной формой вириона и формированием
полиэдров не в ядре клетки,
а в цитоплазме.
Систематическая х ар а к т ер и с ти к
а . Систематическая принадлежность
вируса цитоплазматического
полиэдроза (ВЦП) пока носит
предположительный характер: его
рассматривают к ак самостоятельную
группу вирусов насекомых,
наиболее сходную с семейством
реовирусов. Н азв ание это обра зовано
первыми буквами трех слов:
resp ira to ry—en te ric—o rp h an s (вдыхательный
op ган-кишечник-лишающий
», в смысле «поражающий»).
Реовирусы — семейство голых вирусов
с вирионами кубическом
симметрии, содержащими двунитчатую
РН К ; впервые описаны Сей-
биным (1959). Все три серотипа
этого вируса широко расп ространены,
являются общими дл я человека
и животных, св я заны с ды хательными
органами и кишечным
трактом и вызывают у млекопитающих
энтероколиты и к а т а ры
верхних дыхательных путей.
Вирус о бра зуе т цитоплазматические включения, состоящие из массы
вирионов, и чрезвы чайно легко ад ап ти р у ется к культивированию на
тк ан ях различного происхождения. Р еовирусы отличаются от энтеровирусов
(в том числе поражающих насекомых) двунитчатой Р Н К (а не
однонитчатой, к ак у энтеровирусов), в два-три раза более крупными
вирионами (60—90 нм), устойчивостью к эфиру и хлороформу, к повышенной
темп ер ату р е (сохраняет жизнеспособность при 56° С в течение
2 ч) и обильным выделением вируса из пораженного кишечного к ан а л а .
Распространенность среди насекомых. Типовым видом я в л я е т с я
вирус цитоплазматического полиэдроза тутового шелкопряда. Среди
свободноживущих представителей энтомофауны ВЦП впервые обн аружен
у гусениц медведицы обыкновенной и медведицы деревенской
(Смит, Вичоф, 1950). Аруга и Танада (1971) составили список 168
видов бабочек, гусеницы которых поражаются ВЦП, а т а кж е два вида
сетчатокрылых, три — двукрылых и один — перепончатокрылых.
Эти сведения не совпадают с теми, которые приведены в обзоре Д эви д а
(1975) — 141 вид чешуекрылых, но все эти и им подобные данные
однозначно свидетельствуют о неизмеримо большей поражаемости
этого отряда насекомых. Позже ВЦП был найден у комара анофелеса,
у личинок хирономид — длинноусых д в у кры лы х и у р яд а др у ги х .
Впрочем, к ак отмечается в обзо р ах , нет еще достаточной увереннос
т и— в с е л и виды в упомянутых с л у ч а я х п ораж алис ь именно этим,
точно идентифицированным вирусом.
Широкому распространению ВЦП в ироде содействует относительн
о н и зк ая степень его видовой специализации. Резу л ь таты многочисленных
опытов перекрестного зар аж ен и я насекомых, в том числе
гусениц и к у к о л о к тутового шелкопряда, говорят о широком видовом
спектре поражаемых насекомых отдельными штаммами вируса. Т а к ,
Нейлсон (1964) испытал инфекционность ВЦП зимней пяденицы на
18 видах бабочек и двух видах перепончатокрылых и на 11 видах п олучил
положительные результаты, в том числе на гусеницах тутового шелк
оп р яд а .
Полиэдры ВЦП. Отличительная особенность ВЦП, так ж е как вируса
ядерного полиэдроза — полиэдры-многогранники, выполняющие
по отношению к вирионам защитную функцию; вирус в полиэдрах
стойко выдерживает внешние воздействия, изолированные же из них
вирионы более чувствительны. Это в особенности относится к сп и р ту ,
хлороформу, дезоксихолевой (желчной) кислоте, но не к эфиру и не
к щелочи (pH 11) или к комнатной температуре, действие которых они
сравнительно хорошо переносят. Вирионы, заключенные в п о л и эд ры ,
длительное время сохраняют инфекционную способность в е с т е с тв ен ных
условиях, если защищены от прямых солнечных, главным о б р а зом
ультрафиолетовых лучей.
Очертания полиэдров ВЦП у тутового шелкопряда варьируют;
с помощью сканирующего электронного микроскопа установлены четыре
формы: ромбический додекаэдр, тетрагональный тритетраэдр,
куб и почти гл обул ярн ая (шаровидная) форма. Наиболее распространен
ромбический додекаэдр, который в поле зрен и я светового микроскопа
(в проекции его на плоскость) имеет вид шестигранника (гекс
а эд р а ). Разм еры полиэдров у тутового шелкопряда (0,5— 15 мкм)
з а ви ся т от уча стка средней кишки, где они образованы, от возраста
(размера) гусениц и величины кле тки , наконец, от их возраста: молодые
полиэдры мельче. Есть ссылки на зависимость размера и формы
от принадлежности к штамму и вирулентности вируса.
Более очевидна с в я з ь формы полиэдров с видом насекомого, в котором
они образованы, а не только с генетической обусловленностью,
вызванной особенностью штамма или вариетета вируса. Е . Абэ (1977)
и зу ч ал кристаллографические формы полиэдров ВЦП к лещ еви н н о го
ш елк оп ряда , японского представителя семейства коконопрядов и н е парного
шелкопряда. Полиэдрами, образованными в эп и тели ал ьны х
клетках гусениц этих трех семейств чешуекрылых, были за р аж ены
то л ько что вылупившиеся гусеницы и гусеницы второго возраста т у тового
шелкопряда. Полиэдры, образованные собственными вирусами,
у гусениц коконопряда и непарника имели форму ромбического д о д е каэдра
или додекаэдра, ограниченного 12 шестиугольниками, у к о т о рых
шесть вершин были усечены маленькими квадратами. У ту то во го
шелкопряда, зараж енного этими вирусами, через 48 ч п о я ви л и с ь
полиэдры с тетрагональными плоскостями, а через 96 ч после з а р аж е ния
— пента-, гекса- и октагональными плоскостями. Квадратны е
поверхности кубического додекаэдра у тутового шелкопряда станови -
лись прямоугольными, а некоторые поверхности ромбического додекаэдра
— пяти- и шестиугольными. Полиэдры ВЦП к лещевинного
шелкопряда не меняли обычной формы, когда образовывались в эп и т е лии
средней кишки тутового шелкопряда, зараж ен н ого этим в и р у сом.
Характеристика вирионов. Вирионы ВЦП тутового шелкопряда,
содержащиеся в полиэдрах, по форме относятся к икосаэдрам (двадцатигранникам)
кубического типа симметрии, т. е. к глобул ярны м
вирусам, лишенным оболочки развития (голым), и имеют удвоенную
нить РН К . Футляр вириона, его капсид, c o c to .it из дв у х кон ц ен три ческих
белковых оболочек с диаметрами соответственно 45 и 69 нм.
Н ар уж н ая оболочка состоит из 12 капсомер, связанных с внутренней
оболочкой 12 трубчатыми образованиями. Выступающие из к а п с о мер
полые трубочки заканчиваются на вершинах икосаэдра сфэри-
ческими тельцами (рис. 6 4—55). Полагают, что эти тел ьца вы п о л н яю т
функцию рецепторов во время контакта вируса с инфицируемой им
клеткой. Морфологические особенности строения ВЦП туто во го ш ел копряда
относятся т а кж е и к ВЦП других насекомых.
Как п о к азали опыты с полиэдрами ВЦП ам ери к анск о го к о л ь ч а того
коконопряда, содержимое сердцевины вириона может быть о св о бождено
обработкой ацетоном от протеинового ф у тл я р а (капсида)
с высоким выходом Р Н К ; этот метод может быть использован и д л я
ВЦП других насекомых (Дэвид, 1975). Р Н К ВЦП тутового щ ел коп ря -
д а состоит из нескольких сегментов разной длины, м о л е к у л я р н а я
масса 13— 18 млн. дальтон. Соединены ли эти сегменты внутри вириона
к как именно — не установлено. У ВЦП тутового шелк опряда все 10
сегментов имеют идентичное концевое строение, содержащее у одной
полинуклеотидной цепочки цитозин, а у другой — урацил. Р Н К ВЦП

кольчатого коконопряда и тутового шелкопряда мэгут быть р а з д е лены
на две разные по численности компонентов электрофоретические
фракции: у коконопряда выявилось шесть комлоненгзз, а у г у г э з т г о —
девят ь (по другим д а н н ы м— 10). Следовательно, Р Н К э ти х дв у х цитоплазматических
вирусов отличаются др у г от д р у г а в с т р у к т у р н ом
отношении. Результаты серологического анализа показали, что вирионы
кистехвоста и американского кольчатого коконопряда с о в е р шенно
отличны от вирионов тутового шелкопряда; в то время к а к
антигены вируса кистехвоста и кокон оп ряд а почти идентичны и ан т и генный
состав их различается то л ько количественно, с вирусом т у т о вого
шелкопряда у них тол ько часть общих д л я всех ВЦП ан ти ге нов.
По составу аминокислот в протеине, экстрагированном из с в о бодных
вирионов, кистехвост и кольчатый коконопряд были подобны,
тогда к ак тутовый ш елк оп ряд существенно отличался.
Пероральное заражение вирусом. Полиэдры, проглоченные с
листьями шелковицы, под действием кишечного сока в средней к иш к е
и пищеварительных ферментов растворяются и находящиеся в них
вирионы освобождаются. Сходные результаты получают вне ор ган и зм а
насекомого, помещая полиэдры в слабый вэдный раствор соды. П о л и эдры
ВЦП растворяются в щелочи несколько труднее, чем у яд ерн ого
полиэдроза. Кроме того, голые вирионы цитоплазматического полиэдроза
более прочно св язаны с белковым матриксом полиэдра, чем
вирионы вируса жел тухи. Хотя свободные вирионы спустя некоторое
время разрушаются в содовом растворе, по данным Хаяши и Кава-
рабаты (1970), более половины находящихся в средней кишке вирионов
(от их общей численности, вк лю чая тех, что в полиэдрах) оказались
в свободном состоянии; часть из них попадает в просвет кишечника
вместе с содержимым полуразрушенных и отторгнутых клеток эпителия.
В
атанабе (1968) проследил за судьбой проглоченных шелковичным
червем полиэдров и временем их появления в экскрементах. Нор
мальный вид экскрементов изменяется спустя некоторое время после
скармливания гусеницам наиболее типичных д л я ВЦП гек са гон ал ьны х
(шестигранных) полиэдров. Экскременты, собранные в день с к а рм л и вания
гусеницам полиэдров, содержали инфекционноспособный ви р у с ,
но спустя три-пять дней после зараж ения экскременты— по р е зу л ь т
а т ам ск армли ван и я их — оказали с ь незаразными. П х л е пяти дней
полиэдры несколько измененной неправильной формы вновь п о яви л
и с ь в экскрементах. По мере разви ти я болезни количество н о рм ал ь ных
гексагональных полиэдров в экскрементах начинало в о зр а с т а т ь ;
особенно многочисленными они становились в последней стадии бол
езн и , когда в результате их скопления экскременты становились
белыми.
По мнению Ватанабе, в первый день исследования экскременты
содерж али то л ько те полиэдры, которые были проглочены гусеницами.
Полиэдры ж е , появившиеся в экскрементах через несколько дн ей ,
были сформированы в зараженном вирусом эпителии; после р а зр уш е ния
эпителиальных клеток они были выделены вместе с эк скр ем ен т
ам и . В начале за р аж ен и я , когда функция с е к р е ти р ую ц ч х к л е то к
эп и тели я не была еще нарушена и кишечный сок был в норме, п оли эдры
испытали на себе его действие и о казались н есколько д еформированными.
По мере развития болезни щелочность кишечного сока постепенно
сн иж ала сь , а количество правильно оформленных, шестигранных
полиэдров возрастало. У гусениц пятого возраста pH кишечного
сока 10,5— 10,7; повышенный уровень щелочности способствует
наиболее полному растворению полиэдров и освобождению вирионов.
Но когда эпителий кишечника сильно поражен вирусом, pH сн иж а е т с я
до 9 ,5 и менее, полиэдры частично не растворяются или р а с т в о р я ются
неполностью, основная масса их выделяется с экскрементами
и количество их п родолжает возрастать.
Проникновение вируса в клетку и его репродукция в ней. Д а л ь нейший
процесс миграции вируса на пути к поражаемой им к л е т к е
н е ясен. По-видимому, чтобы достичь эпителиальных клеток с р е д ней
кишки, он должен пройти сквозь перитрофическую м ембрану.
О процессе зар аж ен и я самих клеток судят главным образом по наб лю дениям
над проникновением вируса, помещенного в к у л ь ту р у к л е то к
(Кобаяш и , 1971). Вирион одним из выступов, заканчивающихся сферическими
тельцами, прикрепляется к поверхности клетки. За тем
содержимое сердцевины вириона по полому выступу капсида п роник
а е т в ее цитоплазму. С тр у кту р а , ок р уж ающая сердцевину вириона,
остается на поверхности атакованной вирусом клетки. Р еп ли кац и я
вирусной Р Н К происходит внутри клеточного ядра, пссле чего она
перемещается в цитоплазму. К, этому времени в цитоплазме инфицир
о в ан н ой клетки отмечается появ/.ение двух неправильных по форме,
более плотных участков, которые предшествуют возникновению сердцевинной
стр у кту ры будущих вирионов. В них выявляются мелкие,
элсктроннс-плотнь .е зерна, диффундирующие по направлению к ви-
рогенной строме, где формируется капсид — белковая оболочка
вириона. Обособление вироплазмы в цитоплазме клетки наблюдается
на пятый день после за р аж ен и я гусеницы. Полиэдры формируются на
поверхности вирогенной стромы, куда диффундируют нити поли-
эдренного бел ка, р а сп о л а г ая с ь среди вирусных частиц и о к р уж а я их;
одновременно с этим белок подвергается процессу к р и с т а л л и з а ции.
В
атанабе (1966, 1967) изучал синтез РН К в пораженных вирусом
к л е тк ах с помощью радиоавтографии и использования меченного т р и тием
(Н 3) уридина — предшественника РН К . В инфицированной в и р у сом
к летке через дв а-пять дней после зараж ен и я большая часть меченого
уридина появляется в ядерной РН К и некоторсе количество —
в цитоплазматической. В яд рах зараженных клеток метка появляется
в больших количествах на поверхности нуклеолей — месте, где сосредоточена
рибосомальная РН К . Сравнивая картину осаждения метки
у здорового и зараженного шелкопряда, Ватанабе смог подтвердить,
что именно нуклеоли являются местом синтеза вирусной РНК*
Радиоавтографирование зараженных клеток на протяжении 24 ч пок
а зал о , что масса радиоактивных зерен густо покрывает поверхность
ядра и сосредоточивается в цитоплазме апикального (верхушечного)
участка эпителиальных клеток. Вирогенная строма образуется в этом
ж е районе клеток, точно так же как при цитоплазматическом поли-
эдрозе у других насекомых. С помощью электронного микроскопа
им было прослежено, как внрусная РН К , образованная в яд р е кле тки
и переместившаяся в ее цитоплазму, участвует в сборке вирионов,
а последние заключаются в полиэдры.
Симптомы цитоплазматического полиэдроза. Вирус з а р аж а е т ц и линдрические
клетки средней кишки и значительно реже — бокаловидные.
По мере р азви ти я вируса клеточные компоненты — митохондрии,
рибосомы и др. разрушаются, исчезают или р асполагают ся
по периферии клетки. Ядра клеток в процессе развития цитопатиче-
ски х явлений почти не изменяются, если не считать небольшого смещения
их в цитоплазме, незначительной складчатости и некоторых
д р у ги х , не всегда заметных признаков деформации. В р езу ль т а т е
зап о лн ен и я вирионами и полиэдрами клетка увеличивается в р а зм е р ах ,
о бол оч ка ее ра зры в а е тс я , а сна сама вытесняется из эпителия регенерати
вны м и клетками, отторгается и оказывается в просвете кишечника.
Х о т я цитоплазматический полиэдроз достаточно жестко приурочен
к узкой зоне п ораж ения, частичный или полный вывод из стр о я
функции средней кишки у личинки влечет за собой нарушение питан и я
всего организма со всеми вытекающими отсюда последствиями, з а т р а гивающими
к ак энергетический, так и плгстический обмен веществ
о р ган и зм а . Первоначально внешние признаки заболевания проступают
не очень отчетливо. По мере развития болезни гусеницы теряю т
аппетит, перестпот реагировать на свежие листья шелковицы. Утрата
пищевого рефлекса сопряжена с сокращением секреторной де я тел ь ности
зш 'т с л и я средней кишки, которое постепенно р а сп р о с тр ан я ется
и на не оккупированную вирусом соковыделительную зо н у .
Количество экскрементов сокращается, они становя тся мягкими,
плохо отпрессованными, сырыми; к концу болезни экскременты п р и обретают
тускло-беловатый, белесый вид, вызванный присутствием
Сольцой массы полиэдров.
Д и а гн о с ти к а . Симптомы этого полиэдроза, по наблюдению я п о н ски
х исследователей, присущи и болезням фляшериепэдобного типа.
Поэтому по одним только внешним признакам различить эти болезни
очень трудно.
Заподозрить зараж ение этим полиэдрозом можно на основании
того, что гусеницы выделяют мягкие («сырые») экскременты беловатого
оттенка, подстилка под ними часто оказывается выпачканной.
Проще всего и надежнее вскрыть гусениц: при цитоплазматическом
полиэдрозе средний отдел кишечника окажется мутно-белым; однако
следует быть осторожным с окончательным суждением, т а к к а к и этот
п ри зн ак может быть вызван другими причинами. Побеление и помутнение,
к ак правило, распространяется от заднего конца средней
кишки к переднему, но при сильном развитии болезни может выйти
за пределы этого участка, когда пораженными вирусом о к аж у т с я
кле тки переднего и заднего отделов кишечника. Если часть средней
кишки заболевшей гусеницы поместить на предметное стекло, то при
600-кратном увеличении микроскопа в нативном препарате (в к ап л е
воды под покровным стеклом) можно увидеть полиэдры в цитоплазме
цилиндрических всасьшакнцих кле тск, которые сосредоточены в задней
трети этого отдела; в бокаловидных (секретирующих) они встречаются
значительно реже.
Эпизоотологические особенности з а б о л е в ан и я . В отличие от яд ер ного
полиэдроза, при котором зараженные гусеницы не выдел яют
с экскрементами полиэдров, при цитоплазматическом полиэдрозе
по мере того, к ак пораженные вирусом клетки кишечника р а з р уш а ются,
образовавшиеся в них полиэдры попадают в пищеварительный
к ан а л и выделяются с экскрементами. В результате они с т ан о в я т ся
главным источником перезаражения гусениц, прежде всего на участк
ах инфицированной таким путем выкормочной поверхности. П р о долж
ительность инкубационного периода болезни зависит от возраста
гусениц, температуры воздуха и дозы вируса, попавшего в орган и зм
ш елкопряда . Если гусениц инокулировать достаточно вирулентным
в и р у с ом , способным вызвать их гибель, а температура в выкормочном
помещении не ниже 2 5 °С , большинство из них умирает на 8— Ю-й
день. В отличие от эпизоотии, вызванной ядерным полиэдрозом,
который характеризуется широкими пространственными участками
сплошного поражения поголовья гусениц, распространение ц и топ л а зматического
полиэдроза нссит разреженный, диффузный х ар ак тер ,
д аж е если численность заболевших высокая.
Некоторые гусеницы пятого возраста, зараженные ВЦП, могут
выжить и превратиться в к уколок и д аж е бабочек. По размерам т аки е
бабочки обычно меньше здоровых; иногда крыл ья у них недоразвиты
или полностью редуцированы. Под влиянием ВЦП у самок оказыв аются
менее развиты яичники и ооциты, что приводит к снижению плодовитости.
Ватанабе и Н ам у р а (1971) впрыскивали в гемоцель (общую
полость) молодых к укол ок шелкопряда ВЦП и вели наблюдение за плодовитостью
и оплодотворяемсстью бабочек от инфицированных к у ко лок;
плодовитость бабочек-вирусоносительниц и оплодотворенность
к ладок несколько снижались д аж е в тех случ аях, когда то л ь ко одна
из спаренных бабочек была зар аж ен а на стадии кукол ки. Возможность
тран со в ари ал ьн ой передачи ВЦ11 у тутового шелкопряда неоднократно
отмечалась в более ранних работах, посвященных этому з а б о леванию
(А р у г а , Нагашима, 1962; Х у к у х ар а , 1962). Имеются наблюдения,
касающиеся латентного состояния ВЦП у тутового ш ел к оп р яда .